Eksperiment til at udføre gramfarvning af bakterier (med figur)

Læs denne artikel for at lære om eksperimentet til at udføre gramfarvning af bakterier for at finde ud af om det er gram-positivt eller gram-negativt!

Formål:

Den vigtigste differentialfarve anvendt i mikrobiologi er gramfarvning.

Det er opkaldt efter Dr. Christian Gram, der kategoriserede bakterier, baseret på forskellene i sammensætningen af deres cellevæg, i to grupper som følger:

(1) Gram-positive bakterier:

Efter farvning af en bakterie med krystalviolet, hvis dens cellevæg modstår affarvning ved vask med et affarvningsmiddel (ethanol eller acetone), er det en gram-positiv bakterie. Eksempler: Bacillus, Staphylococcus.

(2) gramnegative bakterier:

Efter farvning af en bakterie med krystalviolet, hvis dens cellevæg tillader affarvning ved vask med et affarvningsmiddel (ethanol eller acetone), er det en gram-negativ bakterie. Eksempler: Escherichia, Salmonella, Vibrio.

Differentiering af bakterier i gram-positive og gram-negative grupper giver det vigtigste spor for at fortsætte yderligere i korrekt retning for identifikation af ukendte bakterier. Det er også nyttigt til simpel differentiering af bakterier til gram-positive og gram-negative grupper. Det giver også en ide om form og arrangement af bakteriecellerne.

Princip:

I gramfarvning farves bakteriecellerne først med en primær plet, krystalviolet, der kommer ind i cellerne og pletter dem lilla-blå. Derefter behandles cellerne med et mordant grams jod, som træder ind i cellerne og binder til den primære plet, der danner et uopløseligt farvestof-kompleks (krystalviolet-iodkompleks), hvilket gør flaskens flugt vanskeligt.

Derefter behandles cellerne med et affarvningsmiddel, såsom ethanol eller acetone. Det virker som et lipidopløsningsmiddel og som et proteindehydratmiddel. I gram-positive celler virker decolouriseringsmidlet oprindeligt som et lipidopløsningsmiddel, som opløser den lille mængde lipid, som er til stede i cellevæggen, hvorved der dannes minutporer i den. Derefter dehydrerer de cellevægsproteiner (peptider), som lukker porerne.

Nu er det farvelægte kompleks vanskeligt at blive fjernet af affarvningsmidlet, og cellerne bevarer den lilla-blå farve af den primære plet. Når modfarves af en pink-rødfarvet plet, safranin, kan den ikke komme ind i cellerne, efterhånden som porerne er lukket.

Cellerne beholder endelig den lilla-blå farve af den primære plet. På den anden side indeholder den gram-negative cellevæg en stor mængde lipid (LPS), som opløses ud af affarvningsmidlet, hvilket resulterer i dannelsen af store porer. Disse porer lukker ikke mærkbart på dehydrering af cellevægsproteiner.

Det er derfor; pletmordantkomplekset undslipper gennem porerne, når det vaskes af affarvningsmidlet, og cellerne virker farveløse. Når modfarves af safranin, trænger den ind i cellerne gennem porerne og endelig tager cellerne den lyserøde-røde farve af modfladen.

Materialer krævet:

Slide, sløjfe, primær plet (krystalviolet), mordant (grams iod), affarvningsmiddel (95% ethanol), modfarvning (safranin), bouillon / skrå / plantekultur af bakterier, mikroskop, nedsænkningsolie.

Procedure:

1. Et objektglas rengøres ordentligt under ledningsvand, således at vand ikke forbliver som dråber på overfladen (Figur 5.11).

2. Det klæbende vand udslettes med bibulous papir og glideren lufttørres.

3. Et smear af bakterier fremstilles i midten af diaset i to metoder som følger.

(en) Hvis en bakterie vokset på agarplade eller agarskråning skal observeres, sættes der en dråbe vand i midten af glideren, og en sløjfe af bakterier fra pladen eller skråningen overføres til den ved en sløjfe steriliseret over flammen. Derefter foretages en bakteriesuspension ved langsom rotation af sløjfen i dråben, og den spredes, indtil et smear opnås.

(B) Hvis en bakterie dyrket i flydende bouillon skal observeres, sættes en dråbe af bakteriesuspensionen direkte i midten af glideren ved hjælp af en flamme-steriliseret sløjfe, og der smøres ved at sprede.

4. Smøret er lufttørret.

5. Smøret fastgøres ved opvarmning. Opvarmning resulterer i koagulering af de cellulære proteiner, hvoraf cellerne holder sig til glidens overflade og ikke vaskes væk under farvning. Varmefiksering sker ved hurtigt at føre glideren højt over en flamme 2-3 gange med smøret Overfladen vender opad, så smøret ikke bliver opvarmet.

6. Glideren holdes på en farveskuffe og oversvømmes med den primære plet, krystalviolet i 1 minut.

7. Overskydende plet vaskes væk fra smøret under forsigtigt flydende ledningsvand, således at vand ikke falder direkte på smøret.

8. Smøret er oversvømmet med mordanten, grams jod, i 1 minut.

9. Overskydende mordant vaskes væk fra smøret under forsigtigt flydende ledningsvand på en sådan måde, at vand ikke falder direkte på smøret.

10. Smøremidlet oversvømmes med affarvningsmidlet, 95% ethanol, i 5 sekunder, idet man sørger for, at smøret ikke er overfarvet.

11. Etanolen vaskes hurtigt væk fra smøret under forsigtigt strømning af ledningsvand for at forhindre overaffarvning. Pas på, så vand ikke falder direkte på smøret.

12. Smøret er oversvømmet med modfarven, safranin i 1 minut.

13. Overskydende pletter vaskes væk fra smøret under forsigtigt flydende ledningsvand, således at vand ikke falder direkte på smøret.

14. Glideren blottet tørt med bibulous papir.

15. Glideren klipses til mikroskopets stadium og smøret observeres under lavt strømforbrug og højt tørre mål.

16. En dråbe nedsænkningsolie sættes på smøret.

17. Smøret er observeret under olieinddrivningsmål.