7 Teknikker til observation af objekter under elektronmikroskop
Nogle af de vigtigste teknikker, der er vedtaget til observation af objekter under elektronmikroskoper, er: (1) Skygge-støbning (2) Negativ farvning (3) Ultra-tynd sektion (4) Frysning (5) Lokalisering af cellekomponenter (6) Lokalisering af enzymer (7) Autoradiografi.
(1) Skygge-støbning:
Ved skyggestøbning tørres den mikroskopiske genstand i et specielt gitter placeret i en vakuumbeholder.
Et ekstremt tyndt lag af metal (f.eks. Platin) aflejres på genstanden fra et stærkt opvarmet filament i skrå vinkel, således at genstanden frembringer en skygge på den ikke-coatede side.
Undersøgelse af det skyggede billede giver information om objektets form (topografiske egenskaber af objektets overflade), som kan observeres ved scanningelektronmikroskop.
(2) negativ farvning:
Denne teknik følges for at observere minut detaljer af meget små genstande, såsom vira og bakterier flagella. Et elektron-uigennemtrængeligt materiale som phosphotungstic syre eller dets salt får lov til at danne et lag tykt depositum på overfladen af genstanden uden at komme ind i den. Når elektroner fra elektronpistolen i elektronmikroskopet ikke kan passere gennem disse belagte overflader, bliver disse strukturer tydeligt synlige.
(3) Ultra-tynd sektion:
En intakt mikrobiell celle er for tyk til at muliggøre visualisering af dens interne fine strukturer under elektronmikroskop. Til observation af de intracellulære fine strukturer er cellen indlejret i en blok af plastmateriale og skåret i ultra-tynde sektioner (så tynde som 60 nm).
Den nøjagtige struktur fortolkes ved at observere flere ultra-tynde skiver snittet på forskellige niveauer og i forskellige vinkler. Forbedring i kontrast af strukturer er mulig ved brug af specielle pletter, såsom uran og lanthansalte.
(4) Fryse-ætsning:
For at opnå ultra-tynde dele af en genstand skal den afhjælpes ved kemiske behandlinger. Sådanne kemiske behandlinger resulterer i artefakter. Disse artefakter overvindes ved fryseproces. I frysetiskning er prøven frosset inde i en blok og er snittet, mens den stadig er indeholdt i den i frosne tilstand.
(5) Lokalisering af cellekomponenter:
Det er en særlig teknik, der udføres for at lokalisere kemiske bestanddele af celler. For eksempel, for at lokalisere et antigen i en celle behandles et ultra-tyndt afsnit af cellen med et ferritin-mærket antistof, som binder til antigenet for at danne ferritin-mærket antistof-antigenkompleks.
Da ferritin er et jernholdigt stof med høj densitet, påvirker antistof-antigenkomplekset markant påvirkning af en elektronstråle, hvorved der frembringes en høj kontrast til klar observation under et elektronmikroskop.
(6) Lokalisering af enzymer:
Denne teknik bruges til at lokalisere enzymernes placering i celler. For eksempel fremstilles ultra-tynde sektioner af bakterieceller ved påvisning af enzymet isocitrat dehydrogenase. Derefter fastgøres kolloidalt guld specifikt til enzymet efter en immunokemisk teknik. Det kolloidale guld-fikserede enzym kan observeres under elektronmikroskop.
(7) Autoradiografi:
Det er en cytokemisk teknik, hvor placeringen af en bestemt kemisk bestanddel i et objekt bestemmes ved at observere stedet, hvor et radioaktivt materiale bliver placeret. Objektet udsættes først for det radioaktive stof for at muliggøre dets optagelse.
Derefter dækkes det med et lag fotografisk emulsion og holdes i mørke i få timer. Den ioniserende stråling, der udsendes under forfaldet af stoffet, frembringer latente billeder i emulsionen. Efter fotografisk behandling ses de udviklede billeder under elektronmikroskop som sølvkorn i præparatet.
