Trin involveret i polymerase-kædereaktion i DNA-sekvens

Nogle af de vigtigste trin involveret i polymerasekædereaktion i DNA-sekvens er: 1. Trin 1: Denaturering ved varme 2. Trin 2: Angivende primer til mål sekvens 3. Trin 3: Forlængelse 4. Trin 4: Slutning af den første PGR-cyklus .

Polymerasekædereaktionen (PGR) amplificerer et enkelt stykke DNA over flere størrelsesordener, se figur 6.2. Det er oprettelsen af ​​tusinder til millioner af kopier af en bestemt DNA-sekvens.

1. Trin 1: Denaturering ved varme:

Varme er normalt mere end 90 grader Celsius ved at separere dobbeltstrenget DNA i to enkeltstrenger. Denne proces er kendt som "denaturering". De hydrogenbindinger der forbinder baserne til hinanden er svage, derfor er denaturering mulig. Brintbindingerne brydes ved høje temperaturer, medens bindingerne mellem deoxyribose og phosphater forbliver intakte, da disse er stærkere forbliver intakte.

2. Trin 2: Annealing Primer til Target Sequence:

Det ultimative mål med PGR er at replikere en målsekvens på ca. 100-600 basepar unikt for organismen, der undersøges. Målretning af sekvensen opnås ved anvendelse af primere. Primers markerer målens sekvensers ender.

AMPLICOR® Testprimere er korte syntetiske sekvenser af enkeltstrenget DNA, der typisk består af 20-30 baser, med en biotin-mærket 5'-ende til hjælp ved påvisning. For organismens målområde er de specifikke. PGR har to primere, en for hver af de komplementære enkelt-DNA-tråde, der blev produceret under denaturering, enkelt-DNA-tråde, der blev produceret under denaturering.

Begyndelsen af ​​DNA-målsekvensen af ​​interesse er markeret af de primere, som anneal (bind) til den komplementære sekvens. Annealing finder sædvanligvis sted mellem 40 grader Celsius og 65 grader Celsius, afhængigt af primers længde og basesekvens.

3. Trin 3: Forlængelse:

Temperaturen hæves til ca. 72 grader Celsius, efter at primerne har blødgjort til de komplementære DNA-sekvenser. Også enzymet Taq DNA-polymerase anvendes til at replikere DNA-strengene. Taq-DNA-polymerase er en rekombinant termostabil DNA-polymerase fra organismen Thermus aquatics os og i modsætning til normale polymerase enzymer er aktiv ved høje temperaturer.

Synteseprocessen syntetiserer nye dobbeltstrengede DNA-molekyler, begge identiske med det oprindelige dobbeltstrengede mål-DNA-område, ved at lette binding og sammenføjning af de komplementære nukleotider, der er fri i opløsning (dNTP'er). Forlængelse begynder altid ved primerens 3'-ende, hvilket gør en dobbelt streng ud af hver af de to enkelt tråde. Taq DNA-polymerase syntetiserer udelukkende i 5'- til 3'-retningen.

4. Trin 4: Slutningen af ​​den første PGR-cyklus:

Der er nu to nye DNA-tråde identiske med det oprindelige mål i slutningen af ​​den første PGR-cyklus. De nyligt dannede tråde har en begyndelse, som netop er defineret af 5'-enden af ​​primeren, men 3'-enden er ikke præcist defineret.

DNA-strengen syntetiseret fra en sådan skabelon har så en præcis defineret længde, som er begrænset i hver ende ved 5'-enden af ​​hver af de to primere. Disse DNA-tråde er kendt som AMPLIGON. DNA-tråde, der svarer til målsekvensen. Efter kun nogle få cyklusser er der til stede i meget større tal end de variable længdesekvenser. Sekvensen flankeret eller defineret af de to primere er den sektion, der forstærkes.