Eksperiment for at isolere kolifager af et virus (med diagram)

Eksperiment for at isolere kolifager af et virus!

Princip:

Den bakteriofag eller fag (virus), der inficerer bakterierne, Escherichia coli hedder colifag (coli: E. coli, fag: bakteriofag).

Det kan opnås fra en række naturlige kilder, såsom jord, fækalt stof og råt spildevand. Dens isolering fra disse kilder er ikke særlig let, da den er til stede i lav koncentration.

Derfor øges først dets antal med et berigelsesstrin, hvor en rig kultur af værtsbakterierne (dvs. E. coli) tilsættes til den coliphage-holdige prøve og inkuberes. Coliphagen inficerer E. coli og øger i antal voldsomt. Denne coliphage-rige kultur centrifugeres for at afgøre det partikelformige materiale.

Sedimentet kasseres, og supernatanten filtreres gennem mikrobielt filter for at bibeholde bakterier og andre partikler, samtidig med at coliphagen kan passere igennem. Filtratet, der er rig på colifag, bruges til at udså en suspension af E. coli, som derefter får lov til at vokse som en sammenflydende græsplæne på en agarplade.

Coliphagen vokser i E. coli-cellerne og lyser dem. Lysis af bakteriecellerne resulterer i dannelsen af ​​klare zoner på bakteriens sammenflydende græsplæne. Disse klare zoner hedder plaques. Hver klar zone antages at være dannet af en enkelt coliphage.

Materialer krævet:

Pipetter, koniske kolber, petriskåle, reagensglas, bomuldspropper, bunsenbrænder, disponere krukke, centrifuge, membranfiltreringsapparat, laminært strømningskammer, autoklave, inkubator, bakteriofag bouillon, trypton blød agar, trypton hård agar, næringsvæske bouillonkultur af bakterier Escherichia coli (fx E. coli B), prøve (fx rå spildevand).

Procedure:

1. Fem pipetter (i rør af rustfrit stål) og fem petriskåle steriliseres i en varmluftsovn ved 180 ° C i 3 timer. Alternativt kan de være dækket af håndværkspapir, bundet med tråd eller gummibånd og steriliseret i en autoklav sammen med mediet (figur 8.5).

2. Ingredienserne af bakteriofag bouillonmedium eller dets færdige pulver, der kræves til 100 ml af mediet, vejes, opløses i 100 ml destilleret vand i en 250 ml konisk kolbe og pH indstilles til 7, 6. Kolben er bomuldsplugget, dækket af håndværkspapir og bundet med tråd eller gummibånd.

3. Indholdet af trypton-blød agar-medium eller dets færdige pulver, der kræves til 100 ml af mediet, vejes, opløses i 100 ml destilleret vand i en 250 ml konisk kolbe og pH indstilles til 7, 5.

4. Dette flydende medium fordeles i 5 reagensglas (2 ml hver), bomuldsplugget, dækket af håndværkspapir og bundet med tråd eller gummibånd.

5. Ingredienserne af trypton-hårdt agarmedium eller dets færdige pulver, der kræves til 100 ml af mediet, vejes og opløses i 100 ml destilleret vand i en 250 ml konisk kolbe ved opvarmning efter pH justering til 7, 5. Kolben er bomuldsplugget, dækket af håndværkspapir og bundet med tråd eller gummibånd.

6. Kolben indeholdende bakteriofag bouillon, de 5 trypton-bløde agarrør, kolben indeholdende trypton-hård agar-medium og en tom bomuldsstoppet 250 ml konisk kolbe steriliseres ved 121 ° C (15 psi tryk) i 15 minutter i en autoklav.

7. Det steriliserede trypton-hårde agarmedium i den koniske kolbe hældes aseptisk i de 5 steriliserede petriskåle og får lov at afkøle for at få 5 trypton-hårde agarplader.

8. I den bomuldsstoppede steriliserede tomme 250 ml koniske kolbe overføres 5 ml steriliseret bakteriofag bouillon, 5 ml E. coli B bouillonkultur og 45 ml rå spildevand aseptisk, fortrinsvis i et laminært strømningskammer (figur 8.6) .

9. Kolben inkuberes ved 37 ° C i 24 timer for at tillade colifagen i spildevandet at proliferere i værtsbakteriecellerne (celler af E. coli B).

10. Indholdet af kolben hældes i 100 ml centrifugerør og centrifugeres ved 2500 omdrejninger per minut i 20 minutter i en centrifuge for at aflejre partiklerne. Sedimentet kasseres.

11. Supernatanten, der er rig på colifag, filtreres gennem et membranfiltreringsapparat. Remanensen kasseres.

12. De fem steriliserede tryptonbløde agarrør tages og opvarmes på et vandbad til 100 ° C for at smelte agaret. Rørene afkøles og holdes ved 45 ° C på et vandbad.

13. Ved hjælp af en steril pipette overføres 1, 2, 3, 4 og 5 dråber af det bakteriefri filtrat, der er rig på colifag, aseptisk til de fem tryptonbløde agarrør.

14. Til hvert trypton-blød agarrør overføres 0, 1 ml af en næringsvæskekultur af Escherichia coli B aseptisk.

15. Indholdet af de fem trypton bløde agarrør med virus, colifag og bakterierne, E. coli B blandes hurtigt ved at rotere rørene mellem håndfladerne.

16. Indholdet hældes over de fem trypton-hårde agarplader (mærket 1 til 5 dråber), hvorved der dannes et dobbeltlagsplantekulturpræparat. Pladerne svirles forsigtigt og får lov at hærde.

17. De podede plader inkuberes i en omvendt position ved 37 ° C i 24 timer i en inkubator.

Observationer:

1. Alle pladerne observeres for plaqueformende enheder (PFU'er), der udvikler sig som klare zoner på græsplænen af ​​bakterier. Plaque formation er indicative for forekomst af colifag i kulturen.

2. Hver plaque repræsenterer en rig vækst af isoleret colifag.

3. Antallet af plaques tælles i alle pladerne og tabuleres som følger (tabel 8.1).

Tabel 8.1: Observationer af antallet af colifag :