Deoxyribonukleasetest på bakterier for at finde ud af deres evner til at hydrolysere DNA (med figur)

Deoxyribonuclease Test (DNase Test) på bakterier for at finde ud af deres evner til at hydrolyse DNA (med figur)!

Princip:

Nogle bakterier har evnen til at hydrolyse deoxyribonukleinsyre (DNA) til oligonukleotider, da de kan producere det ekstracellulære hydrolytiske enzym 'deoxyribonuclease' (DNase).

Mens DNA'et udfældes med saltsyrefrembringende opacitet, får dets hydrolyserede slutprodukter, oligonukleotider, ikke præcipiteret med saltsyre, for hvilke de ikke frembringer sådan uigennemsigtighed; Fremmer snarere gennemsigtighed.

I DNase-testen dyrkes testbakterierne på agarplader indeholdende DNA. Efter kolonier af bakterierne er synlige, oversvømmes pladerne med saltsyre. Hvis bakterierne har evnen til at hydrolyse DNA, hydrolyserer dets kolonier DNA'et i mediet i de områder, der omgiver dem, mens resten af pladerne indeholder uhydrolyseret DNA.

Som et resultat dannes der gennemsigtige klare zoner omkring kolonierne, når de oversvømmes med saltsyre, da de hydrolyserede produkter, oligonukleotider, der dannes omkring dem, ikke danner bundfald med saltsyre.

På den anden side bliver resten af pladerne uigennemsigtige, da det uhydrolyserede DNA i disse områder danner udfældninger med saltsyre. Hvis toluidinblåt anvendes i stedet for saltsyre, produceres en rosenrosa halo kun omkring kolonierne.

Materialer krævet:

Petriskåle, konisk kolbe, bomuldspropper, inokuleringssløjfe, autoklave, bunsenbrænder, laminarflowkammer, kassér krukke, inkubator, DNase agar, IN saltsyre (eller 0, 1% toluidinblåt), isolerede kolonier eller rene bakteriekulturer.

Procedure:

1. To petriskåle er rengjort, dækket med håndværkspapir og bundet med tråd eller gummibånd (Figur 7.23). Dette trin såvel som steriliseringen af petriskålene i trin 6 udelades, hvis ovnssteriliserede petriskåle anvendes direkte.

2. Ingredienserne af DNase agarmedium (indeholdende DNA som hovedkomponent) eller dets færdige pulver, der kræves til 100 ml af mediet, vejes og opløses i 100 ml destilleret vand i en 250 ml konisk kolbe ved omrystning og hvirvling.

3. pH-værdien bestemmes ved hjælp af et pH-papir eller en pH-meter og justeres til 7, 2 ved anvendelse af 0, 1 N HCI, hvis det er mere eller ved anvendelse af 0, 1 N NaOH, hvis det er mindre.

4. Kolben opvarmes for at opløse agaret i mediet fuldstændigt.

5. Kolben er bomuldsplugget, dækket af håndværkspapir og bundet med tråd eller gummibånd.

6. De to petriskåle og den koniske kolbe indeholdende DNase agar-medium steriliseres ved 121 ° C (15 psi tryk) i 15 minutter i en autoklav.

7. Efter sterilisering fjernes de fra autoklaven og får lov at afkøle i nogen tid uden at lade mediet størkne. Køling af mediet forhindrer kondensering og akkumulering af vanddråber inde i pladerne. Hvis mediet allerede er blevet tilberedt og størknet under opbevaring, skal det være flydende ved opvarmning forsigtigt, indtil det smelter fuldstændigt.

8. For at fremstille DNase-agarplader, afkøles og størkner det i steriliseret DNase-agar-medium i varm smeltet tilstand det aseptisk, fortrinsvis inden i et laminært strømningskammer, i de to steriliserede petriskåle (ca. 20 ml hver), således at det smeltede medium dækker helt bunden af petriskålene.

Derefter er pladerne dækket med deres låg og lades afkøle for at størkne mediet i dem. Vanddamp, der kan kondensere på pladens og lågs indvendige overflade, inddampes ved at holde pladerne og lågene i omvendt position i en inkubator ved 37 ° C i ca. 1 time.

9. Hver plade er markeret på undersiden i fire kvartaler.

10. "Spot-inokulering" af testbakterierne udføres aseptisk, fortrinsvis inden i et laminært strømningskammer, i midten af hvert kvartal ved at gøre en plet (eller lille smear) af bakterierne ved hjælp af en flamme-steriliseret sløjfe. Sløjfen steriliseres efter hver inokulation.

11. De podede plader inkuberes i omvendt position, top ned ved 37 ° C i 24 til 48 timer i en inkubator indtil kolonier af bakterierne er synlige.

12. Pladerne oversvømmes med opløsning af 1 N saltsyre (eller 0, 1% toluidinblåt).