Transgene dyr: Målsætninger for genoverførsel med forskellige transfektionsmetoder

Transgene dyr: Målsætninger for genoverførsel med forskellige transfektionsmetoder!

Et transgen dyr indeholder i sit genom et gen eller gener indført ved en eller anden transfektionsteknik.

Genet introduceret ved transfektion hedder et transgen. I dyr specificerer transfektion introduktionen af ​​et DNA-segment, enten nøgen eller integreret i en vektor, ind i en dyrecelle.

Målsætninger for genoverførsel:

1. Genetisk modifikation af dyr kan være rettet mod at forbedre deres mælk, kød, uld mv. Produktion.

2. Gen er blevet overført til dyr for at opnå en stor skala produktion af proteinerne kodet af disse gener i mælken, urinen eller blodet af sådanne dyr.

3. Et særligt tilfælde af genoverførsel tager sigte på at lindre eller endog eliminere symptomer og følgeskader i genetiske sygdomme. I denne tilgang indføres normale og funktionelle kopier af det defekte gen i patienten (genterapi).

4. Specifikke transgene dyrestammer eller -linier er skabt til at opfylde specialiserede eksperimentelle og / eller biomedicinske behov.

Transfektionsmetoder:

Adskillige fremgangsmåder er blevet anvendt til indføring af DNA i dyreceller / embryoner, der er som følger:

(i) Udfældning af calciumphosphat.

(ii) Direkte mikroinjektion.

(iii) Retrovirusinfektion.

(iv) lipofektion

(v) Levering af partikelpistoler og

(vi) Elektropoiering.

Udfældning af calciumphosphat:

I denne fremgangsmåde opløses DNA-præparatet, som skal anvendes til transfektion, først i en phosphatbuffer. Calciumchloridopløsning tilsættes derefter til DNA-opløsningen; dette fører til dannelsen af ​​uopløseligt calciumphosphat, som samfældes med DNA'et. Calciumphosphat-DNA-bundfaldet tilsættes til cellerne, der skal transficeres.

Fældningspartiklerne indtages af cellerne ved phagocytose. Oprindeligt blev 1-2% af cellerne transficeret ved denne fremgangsmåde. Men proceduren er nu blevet modificeret for at opnå transfektion af op til 20% af cellerne. I en lille del af de transficerede celler bliver DNA'et integreret i cellegenomet, som frembringer stabil eller permanent transfektion.

Denne generelle tilgang kan anvendes på stort set alle pattedyrceller, og et meget stort antal celler kan behandles med ringe indsats. Men mange cellelinjer kan ikke lide, at calciumphosphatfældningen klæber til deres overflader eller på deres substrat.

lipofektion:

Levering af DNA i celler ved anvendelse af liposomer kaldes lipofektion. Liposomer er små vesikler fremstillet ud fra et passende lipid. I begyndelsen blev nonioniske lipider anvendt til fremstilling af liposomer, således at DNA måtte introduceres i vesiklerne efter specifikke indkapslingsprocedurer.

Anvendelsen af ​​kationiske lipider til opbygningen af ​​liposomer er en tydelig fordel, da DNA spontant og effektivt komplekser med disse liposomer, hvilket gør indkapslingsprocedurer unødvendige. De kationiske liposomer har en enkelt lipid-dobbeltlagsmembran (unilamellar), og de binder effektivt til cellerne. Sandsynligvis smelter de sammen med plasmamembranen og derved leverer DNA'et (kompleksbundet med dem) ind i cellerne, hvilket medfører transfektion.

Lipofektion er den valgte metode til transfektion af pattedyrsceller in vitro. Det har også været brugt til at levere DNA til levende dyr ved direkte injektion eller intravenøs injektion. Kationiske liposomer er blevet anvendt i intravenøs eller intratracheal injektion i mus for ekspression af markørgener i lunger. Målrettet levering er også blevet demonstreret ved inkorporering af specifikke ligandproteiner i liposomemembranerne.

Retroviral Infektion:

Rekombinante retrovirus producerer virioner, som anvendes til at inficere dyrceller og musembryoer. Det rekombinante retrovirus-RNA-genom kopieres ved revers transkriptase for at give en DNA-kopi (indtægtstransskription), som bliver integreret i cellens genom. Den omvendte transkriptase kodes af retroviruset og fremstilles umiddelbart efter infektion.

Den omvendte transkription kan imidlertid kun forekomme i de celler, der går gennem S-fasen, dvs. er mitotisk aktive. DNA-kopien af ​​det rekombinante retrovirus integreres i det cellulære genom på tilfældige steder og er normalt ikke ledsaget af deletioner eller omlejringer.

mikroinjektion:

Ved denne metode injiceres DNA-opløsning direkte i kernen i en celle eller ind i hanproteuklen fra et befrugtet en til to-celle æg. Typisk består en mikroinjektionskonstruktion af et lav-effekt stereoskopisk dissekeringsmikroskop (for at se ægget og hele processen) og to mikromanipulatorer, en til en glasmikropipette for at holde ægget ved delvis sugning og den anden for en glasinjektionsnål for at introducere DNA i male pronucleus. Male pronucleus er meget større end den kvindelige pronucleus af befrugtede pattedyrs æg. Imidlertid sprøjtes DNA'et i ægcytoplasma i fiskens æg.

Den generelle procedure for mikroinjektion er som følger: Donorhunner induceres til super-ægløsning ved anvendelse af passende hormonbehandlinger. De superovulerede hunner bliver så parret med frugtbare hanner, og stort antal befrugtede en eller tocelle æg / embryoner samles kirurgisk. Alternativt opsamles ubefrugtede æg fra super-ovulerede kvinder; ægget befrugtes derefter in vitro. Transgenkonstruktionen fremstilles i en bufferopløsning og injiceres i hanproteogen af ​​befrugtede æg ved anvendelse af en mikroinjektionsenhed.