Lipidhydrolysestest på bakterier for at finde ud af deres evne til at hydrolysere lipider (med figur)

Læs denne artikel for at lære om lipidhydrolysetesten for at finde ud af, om en bakterie kan hydrolysere lipider (fedtstoffer)!

Princip:

Nogle bakterier har evnen til at hydrolyse lipider (fedtstoffer) til glycerol og fedtsyrer, da de har lipolytisk enzym 'lipase'.

Disse bakterier kaldes lipolytiske bakterier. Mens lipiderne danner en emulsion, danner de ikke hydrolyserede slutprodukter, glycerol og fedtsyrer, når de dispenseres i agar, dannelse af opacitet, ikke sådanne emulsioner med agar, for hvilke de ikke frembringer en sådan opacitet; Fremmer snarere gennemsigtighed.

I lipidhydrolysetesten dyrkes testbakterierne på agarplader indeholdende tributyrin som lipidsubstratet. Tributyrin danner en emulsion, når den dispenseres i agaren, hvilket frembringer et uigennemtrængeligt medium.

Hvis bakterierne har evnen til at hydrolyse lipider, hydrolyserer kolonierne tributyrin i mediet i de områder, der omgiver dem til opløselig glycerol og fedtsyrer (smørsyre), mens resten af pladerne indeholder uhydrolyseret tributyrin.

Som et resultat dannes der gennemsigtige klare zoner omkring kolonierne, da de hydrolyserede produkter, glycerol og fedtsyrer, der dannes omkring dem, ikke danner emulsion med agar. På den anden side forbliver resten af pladerne uigennemsigtige, da den uhydrolyserede tributyrin i disse områder danner en emulsion med agar.

Materialer krævet:

Petriskåle, konisk kolbe, bomuldspropper, inokuleringssløjfe, autoklave, bunsenbrænder, laminarstrømskammer, kassér krukke, inkubator, tributyrinagar, isolerede kolonier eller rene bakteriekulturer.

Procedure:

1. To petriskåle rengøres, dækkes med håndværkspapir og bundet med tråd eller gummibånd (Figur 7.22). Dette trin såvel som steriliseringen af petriskålene i trin 6 udelades, hvis ovnssteriliserede petriskåle anvendes direkte.

2. Ingredienserne af tributyrinagarmedium (undtagen tributyrin, som er lipidkomponenten) eller dets færdige pulver, der kræves til 100 ml af mediet, vejes og opløses i 100 ml destilleret vand i en 250 ml konisk kolbe ved omrystning og hvirvlende.

3. pH-værdien bestemmes ved hjælp af et pH-papir eller en pH-meter og justeres til 7, 2 ved anvendelse af 0, 1 N HCI, hvis det er mere eller ved anvendelse af 0, 1 N NaOH, hvis det er mindre.

4. Kolben opvarmes for at opløse agaret i mediet fuldstændigt.

5. Efter afkøling til ca. 90 ° C tilsættes tributyrin og emulgeres i en Warring-blender.

6. Kolben er bomuldsplugget, dækket af håndværkspapir og bundet med tråd eller gummibånd.

7. De to petriskåle og den koniske kolbe indeholdende tributyrinagarmedium steriliseres ved 121 ° C (15 psi tryk) i 15 minutter i en autoklav.

8. Efter sterilisering fjernes de fra autoklaven og får lov at afkøle i nogen tid uden at lade mediet størkne. Køling af mediet forhindrer kondensering og akkumulering af vanddråber inde i pladerne. Hvis mediet allerede er blevet tilberedt og størknet under opbevaring, skal det være flydende ved opvarmning forsigtigt, indtil det smelter fuldstændigt.

9. For at fremstille tributyrin-agarplader, før det steriliserede tributyrinagarmedium afkøles og størkner i varm smeltet tilstand, hældes den aseptisk, fortrinsvis inden i et laminært strømningskammer, ind i de to steriliserede petriskåle (ca. 20 ml hver), således at det smeltede medium dækker helt bunden af petriskålene.

Derefter er pladerne dækket med deres låg og lades afkøle for at størkne mediet i dem. Tributyrin danner en emulsion, når den dispenseres i agar, hvilket producerer et uigennemtrængeligt medium. Vanddamp, der kan kondensere på pladens og lågs indvendige overflade, inddampes ved at holde pladerne og lågene i omvendt position i en inkubator ved 37 ° C i ca. 1 time.

10. Hver plade er markeret på undersiden i fire kvartaler.

11. "Spot-inokulering" af testbakterierne udføres aseptisk, fortrinsvis inden i et laminært strømningskammer, i midten af hvert kvartal ved at gøre en plet (eller lille smear) af bakterierne ved hjælp af en flamme-steriliseret sløjfe. Sløjfen steriliseres efter hver inokulation.

12. De podede plader inkuberes i omvendt position, top ned ved 37 ° C i 24 til 48 timer i en inkubator indtil kolonier af bakterierne er synlige.