Formålet med at isolere forskellige bakterier findes i en given prøve og opretholde deres rene kulturer

Målet er at isolere forskellige bakterier til stede i en given prøve og bevare deres rene kulturer.

Formål:

Bakterier fundet i naturen, forekommer ikke som adskilte arter, men de opstår som blandede populationer af forskellige arter.

Derfor er det først nødvendigt at adskille dem fra den blandede befolkning for at studere de enkelte bakteriearter. Denne proces kaldes 'isolering af bakterier'.

Det opnås ved at dyrke den blandede population af bakterier på overfladen af et fast medium i diskrete kolonier. 'Kolonier' er individuelle, makroskopisk synlige masser af bakterier dyrket på overfladen af fast medium, som hver repræsenterer multiplikationen af en enkelt bakterie.

Da hver koloni kommer fra væksten og gentagen multiplikation af en enkelt bakterie, tilhører alle de bakterier, der findes i kolonien, af samme art. Således repræsenterer hver koloni en meget stor population af en enkelt bakterieart.

Disse kolonier overføres aseptisk til at adskille nærings agar skråninger og får lov til at vokse der. De isolerede arter af bakterier, der vokser særskilt på agarskæl, kaldes 'rene kulturer'. I hver 15 til 30 dage overføres de til friske skråninger, så de ikke mister deres oprindelige egenskaber på grund af overfyldning, mangel på næringsstoffer og ophobning af metabolitter.

På denne måde opretholdes rene kulturer af bakterier i laboratoriet ved gentagen overførsel til friske skråninger med jævne mellemrum. Denne proces er kendt som "vedligeholdelse af ren kultur". Rene kulturer opretholdes i laboratoriet for deres efterfølgende identifikation ved forskellige farvnings-, biokemiske, serologiske og molekylære teknikker såvel som til deres fremtidige anvendelse.

'Kulturer' er standard rene kulturer, hvis identifikation er blevet etableret internationalt til slægts-, art-, underarter, type eller undertype. De opretholdes i internationalt anerkendte mikrobiologiske laboratorier.

Andre laboratorier kan få dem fra disse laboratorier og vedligeholde i deres egne laboratorier som deres stamkulturer ved gentagen overførsel til friske skråninger med jævne mellemrum. De anvendes til bekræftet identifikation af rene kulturer opnået i disse laboratorier ved sammenligning af deres egenskaber med dem fra standardlagerkulturer.

Princip:

Den blandede population af bakterier, der er til stede i et givet materiale (faststof, væske eller overflade) dyrkes på nærings agarplader ved hjælp af spredte plader eller strimmelpladefremgangsmåder som tidligere beskrevet under 'Dyrkning af bakterier'. Hver isoleret koloni fundet på en agarplade består af en art bakterier, da hver koloni vokser fra en enkelt bakterie.

Således isoleres bakterier på agarplader ved to teknikker som følger:

(a) Spredte plade teknik

(b) Streak plade teknik

Repræsentative kolonier (kolonier med ulige karakteristika) udvælges og aseptisk inokuleres for at adskille agar-slanger for at opnå de rene kulturer. Efter hver 15 til 30 dage overføres de til friske skråninger til vedligeholdelse af disse rene kulturer.

Materialer krævet:

Testglas (5 nos.), 250 ml konisk kolbe (1 nej), 0, 1 N NaOH, 0, 1 N HCI, destilleret vand, nærings agar, ikke-absorberende bomuld, sløjfe, håndværk papir, tråd (eller gummibånd), pH papir (eller pH-meter), bunsenbrænder, autoklav, laminært strømningskammer, inkubator, plader indeholdende isolerede kolonier af bakterier (spredplader eller strimler).

Procedure:

1. Ingredienserne af næringsmiddelagarmedium eller dets færdige pulver, der kræves til 100 ml af mediet, vejes og opløses i 100 ml destilleret vand i en 250 ml konisk kolbe ved omrystning og hvirvling (figur 6.4).

2. pH-værdien bestemmes ved anvendelse af et pH-papir eller en pH-meter og justeres til 7, 0 ved anvendelse af 0, 1N HC1, hvis det er mere eller ved anvendelse af 0, 1N NaOH, hvis det er mindre.

3. Kolben opvarmes for at opløse agaret i mediet fuldstændigt.

4. Før det størkner, fordeles mediet i varm smeltet tilstand i 5 reagensglas (ca. 20 ml hver).

5. Testrørene er bomuldstoppede, dækket af håndværkspapir og bundet med tråd eller gummibånd.

6. De steriliseres ved 121 ° C (15 psi tryk) i 15 minutter i en autoklav.

7. Efter sterilisering fjernes de fra autoklaven og holdes i en skrå position for at afkøle og størkne mediet. Disse reagensglas indeholdende størknet næringsstof-agarmedium i skrå tilstand kaldes 'næringsmiddel-agar-slanger'.

8. Trin 10 og 11 bør udføres efter aseptisk teknik, fortrinsvis i et laminært strømningskammer. Munden af beholderne indeholdende steriliserede medier eller kulturer skal vises over flammen af bunsenbrænderen, efter at du har fjernet bomuldsstikket, og inden du sætter den tilbage.

Loops, før brug skal steriliseres over flamme ved opvarmning til rødt og derefter afkøling i 30 sekunder for at afkøle til stuetemperatur. De bør aldrig bruges, når de er meget varme, da de dræber mikroberne, når de rører dem.

9. I det foregående eksperiment udvælges fem kolonier med forskellige karakteristika som repræsentative kolonier, hvis isolerede kolonier kunne observeres på spredpladen eller stribepladen.

10. En sløjfe steriliseres over flamme, og en sløjfe af bakterier fra hver af de repræsentative kolonier tages aseptisk. Sløjfen introduceres i agarskråningen, således at sløjfen af bakterier går til enden af skråningen. Sløjfen bevæges udad på en bølget måde, der berører overfladen af skråningen, således at der dannes en bølgeformet linje.

11. Sløjfen er flamsteriliseret og på lignende måde inokuleres resten af de fire repræsentative kolonier separat i venstre over fire skråninger. Sløjfen steriliseres efter hver inokulation.

12. De fem podede slanger inkuberes ved 37 ° C i 24 timer i en inkubator.

Observationer (kulturelle karakteristika):

(i) En bølget linje med vækst langs dens længde observeret:

Væksten har fundet sted.

Skråningen observeres for skrå karakteristika som følger (Figur 6.5).

1. Vækstmængde:

Mængden af vækst betegnes som ingen, let, moderat eller stor.

2. Pigmentering:

Kromogene mikroorganismer kan producere intracellulære pigmenter, der er ansvarlige for farven af organismen som set i overfladekolonier. Andre organismer producerer ekstracellulære opløselige pigmenter, der udskilles i mediet og også producerer en farve. De fleste organismer er imidlertid ikke-kromomere og vil fremstå hvide til grå.

3. Optiske egenskaber:

Optiske egenskaber kan vurderes på baggrund af mængden af lys transmitteret gennem væksten.

Disse egenskaber beskrives som:

(en) Uigennemsigtig: Ingen lystransmission.

(B) Gennemsigtig: Delvis lystransmission.

4. Formular:

Udseendet af enkeltlinjestrengen af vækst på agaroverfladen betegnes som følger:

(en) Filiform: Kontinuerlig, trådformet vækst med glatte kanter.

(B) Echinulate: Kontinuerlig, trådlignende vækst med uregelmæssige kanter.

(D) Effuse: Tynd, spredning af vækst.

(E) Arborescent: Træagtig vækst.

(f) Rhizoid: Rotlignende vækst.

(ii) Ingen vækst langs inokulationslinjen:

Fejlteknik til podning, Inokulation gentages. C Opregning af bakterier.

C. Opregning af bakterier:

Omfanget af bakteriel aktivitet i en given prøve i et bestemt sæt betingelser afhænger hovedsageligt af det samlede antal bakterier, der er til stede i det, uanset deres art. Derfor er det meget ofte nødvendigt at finde ud af det samlede antal bakterier, der er til stede i prøver af mad, vand, jord, luft og væv under deres mikrobiologiske analyse.

Estimering af antallet af bakterier i en given prøve kaldes 'opregning af bakterier'. Der findes forskellige metoder til opsummering af bakterier som angivet nedenfor. Alle disse metoder kræver, at bakterier er til stede i en homogen suspension.

Derfor antages væskeprøver at være homogene suspensioner af bakterier og anvendes direkte, mens faste prøver homogeniseres i sterile saltopløsninger for at få homogene suspensioner af bakterier.

Ikke almindeligt anvendt:

(I) Direkte metoder:

(a) Direkte mikroskopisk tælling

(b) Elektronisk celletæller

(II) Indirekte metoder:

(D) Turbidimetrisk metode

(E) Membranfilterantal

Mest udbredte:

(f) Seriefortyndings-agarbelægningsmetode eller Total Plate Count-metode (TPC-metode)

(a) Direkte mikroskopisk antal:

Ved denne metode tælles antallet af bakterier i en alikvot af den homogene suspension af bakterier direkte under et mikroskop, og det totale antal bakterier i prøven bestemmes matematisk.

Fordelen ved denne metode er, at den er meget hurtig. Ulempen er, at både levende (levedygtige) og døde celler tælles, og metoden er ikke følsom over for befolkninger på under en million bakterier pr. Milliliter.

Tælling kan ske i to metoder som følger:

(i) Petroff-Hauser-kammeret:

Det er et specialtællingskammer, hvor en alikvot af den homogene suspension af bakterier sættes til tælling direkte under et mikroskop.

(ii) Breed Smear:

Bakterieceller tælles direkte under mikroskop ved hjælp af farvede smører, der er begrænset til et område på 1 mm ² på objektglasset. Det anvendes hovedsagelig til opregning af bakterier i mælk.

(b) Elektronisk celletæller:

En elektronisk celletæller som "Coulter counter" bruges til direkte at tælle antallet af bakterieceller. En homogen suspension af bakterieceller fremstillet i en ledende væske får lov at passere gennem en minutsåbning, på hvilken en elektrisk strøm strømmer.

Modstanden ved åbningen registreres elektronisk. Når en celle passerer gennem åbningen, er ikke-leder, øger den modstanden øjeblikkeligt. Antallet af gange modstand stiger kort tid registreres elektronisk, hvilket angiver antallet af bakterier, der er til stede i suspensionen.

Fordelen ved denne metode er, at den er ekstremt hurtig. Ulemperne er, at både levende (levedygtige) og døde celler tælles, og instrumentet kan ikke skelne mellem bakterieceller og inert partikelformigt materiale.

(c) kemiske metoder:

Disse metoder estimerer mængden af disse stoffer, især kemikalier, som stiger med stigningen i bakteriepopulationen.

De vigtigste parametre estimeret er som følger:

(i) Proteinkoncentration

(ii) DNA-koncentration

(iii) tørvægt

(iv) Kuldioxidproduktion

(v) Oxygenoptagelse

(vi) Melkesyreproduktion

(d) Turbidimetrisk metode:

Når bakterier dyrkes i flydende næringsrige medier (fx næringsmedium), giver deres kraftige vækst medierne grumle, da bakteriecellerne for det meste forbliver suspenderet i dem. Turbiditeten stiger med stigning i antallet af celler i medierne. Når turbiditeten øges, øges mediernes 'absorbans' eller 'optiske densitet (OD)'.

OD'en af suspensionen af bakterieceller i medierne måles under anvendelse af et spektrofotometer ved 600 nm. Antallet af bakterieceller i suspensionen er fundet ud ved at sammenligne OD med en standardkurve fremstillet ved at plotte OD-værdierne for forskellige kendte koncentrationer af bakterier. Metoden er hurtig, men begrænset til bakterielle suspensioner af mere end 10 millioner celler.

(e) Membranfilterantal:

Denne metode anvendes, når antallet af bakterier i en flydende prøve er meget mindre. For at forøge koncentrationen af bakterier filtreres først væskeprøven aseptisk gennem et steriliseret membranfilterapparat under anvendelse af et sterilt membranfilter.

Membranfilteret indeholdende de fangne bakterier overføres aseptisk til en steril petriskål, der indeholder en absorberende pude, der er mættet med et selektivt differentielt flydende medium. Mediumet oser på overfladen af filteret. Efter inkubation tælles antallet af kolonier dannet på filteret ved anvendelse af et simpelt mikroskop.