Stivelsehydrolysestest på bakterier for at finde ud af deres evne til at hydrolysere stivelse

Stivelsehydrolysestest på bakterier for at finde ud af deres evne til at hydrolysere stivelse!

Princip:

Nogle bakterier har evnen til at hydrolyse stivelse, da de kan producere saccharolytisk enzym.

Mens stivelsen danner mørkblå farve med iod, får de hydrolyserede slutprodukter ikke sådan mørkblåt farve med iod.

I stivelseshydrolysetesten dyrkes testbakterierne på agarplader indeholdende stivelse. Efter kolonier af bakterierne er synlige, oversvømmes pladerne med iodopløsning. Hvis bakterierne har evnen til at hydrolyse stivelse, hydrolyserer kolonierne stivelsen i mediet i de omkringliggende områder, mens resten af pladerne indeholder uhydrolyseret stivelse.

Som følge heraf dannes der gennemsigtige klare zoner omkring kolonierne, når de oversvømmes med jodopløsningen, da de hydrolyserede produkter, der dannes omkring dem, ikke danner mørkblåt farve med iod. På den anden side bliver resten af pladerne mørkeblå, da jod danner mørkblåt farve med den ikke-hydrolyserede stivelse i disse områder.

Materialer krævet:

Petriskåle, konisk kolbe, bomuldspropper, inokuleringssløjfe, autoklave, bunsenbrænder, laminært strømningskammer, kassér krukke, inkubator, stivelsesagar, Lugol's iodopløsning, isolerede kolonier eller rene bakteriekulturer.

Procedure:

1. To petriskåle er rengjort, dækket med håndværkspapir og bundet med tråd eller gummibånd (Figur 7.21). Dette trin såvel som steriliseringen af petriskålene i trin 6 udelades, hvis ovnsteriliserede petriskåle anvendes direkte.

2. Ingredienserne af stivelsesagarmedium (indeholdende stivelse som hovedkomponent) eller dets færdige pulver, der kræves til 100 ml af mediet, vejes og opløses i 100 ml destilleret vand i en 250 ml konisk kolbe ved omrystning og hvirvling.

3. pH-værdien bestemmes ved hjælp af et pH-papir eller en pH-meter og justeres til 7, 2 ved anvendelse af 0, 1 N HCI, hvis det er mere eller ved anvendelse af 0, 1 N NaOH, hvis det er mindre.

4. Kolben opvarmes for at opløse agaret i mediet fuldstændigt.

5. Kolben er bomuldsplugget, dækket af håndværkspapir og bundet med tråd eller gummibånd.

6. De to petriskåle og den koniske kolbe indeholdende stivelsesagar-medium steriliseres ved 121 ° C (15 psi tryk) i 15 minutter i en autoklav.

7. Efter sterilisering fjernes de fra autoklaven og får lov at afkøle i nogen tid uden at lade mediet størkne. Køling af mediet forhindrer kondensering og akkumulering af vanddråber inde i pladerne. Hvis mediet allerede er blevet tilberedt og størknet under opbevaring, skal det være flydende ved opvarmning forsigtigt, indtil det smelter fuldstændigt.

8. For at fremstille stivelsesagarplader, før det steriliserede stivelsesagarmedium afkøles og størkner i varm smeltet tilstand, hældes den aseptisk, fortrinsvis inden i et laminært strømningskammer, ind i de to steriliserede petriskåle (ca. 20 ml hver), således at det smeltede medium dækker helt bunden af petriskålene.

Derefter er pladerne dækket af deres låg og lades afkøle for at størkne mediet i dem. Vanddamp, som kan kondensere på pladens og lågs indvendige overflade, inddampes ved at holde pladerne og lågene i en omvendt position i en inkubator ved 37 ° C i ca. 1 time.

9. Hver plade er markeret på undersiden i fire kvartaler.

10. "Spot-inokulering" af testbakterierne udføres aseptisk, fortrinsvis inden i et laminært strømningskammer, i midten af hvert kvartal ved at gøre en plet (eller lille smear) af bakterierne ved hjælp af en flamme-steriliseret sløjfe. Sløjfen steriliseres efter hver inokulation.

11. De podede plader inkuberes i omvendt position, top ned ved 37 ° C i 24 til 48 timer i en inkubator indtil kolonier af bakterierne er synlige.

12. Pladerne oversvømmes med Lugols iodopløsning.