Plasmider: Overførsel af plasmid-DNA og dets egenskaber

Læs disse artikler for at få oplysninger om overførsel af plasmid DNA og dets egenskaber.

Plasmider er ekstra kromosomale cirkulære DNA-molekyler, der findes i de fleste bakteriearter og i nogle arter af eukaryoter. Under normale betingelser kan et bestemt plasmid dispenseres til dets værtscelle. Mange plasmider indeholder plasmidgener, der kan være essentielle i visse miljøer, fx 'R' plasmidbærende gener, som giver resistens over for mange antibiotika, således at cellen indeholdende dette plasmid kan modstå antibiotisk virkning.

Med kun én undtagelse (killer plasmid af Yeast, et RNA molekyle) er alle kendte plasmider supercoiled cirkulært DNA. Molekylvægten ligger i området fra 106 til ¹⁰⁸ . Antallet af kopier af et plasmid / celle varierer fra 1-2 til 10-60.

Plasmid DNA kan isoleres fra bakterier ved dyrkning af plasmidholdige bakterier. Vaskemiddel tilsættes til det for at få lyserede bakterier. Lysatet centrifugeres. Det mindre plasmid-DNA forbliver i supernatanten. CsCl og ethidiumbromid sættes til supernatanten CsCl danner en densitetsgradient. Det supercoiled DNA med høj densitet kan identificeres ved ethidiumbromid og fjernes let.

Overførsel af plasmid-DNA:

Bakterien E. coli besidder 2 parringstyper, dvs. donorer eller mandlige og modtagere eller kvinder. Maleness determinant er 'F'- eller sexplasmidet eller donoren, en hancelle betegnes som F ⁺ . Kvinde mangler 'F' plasmid og betegnes som F ^- . Når kulturen af ​​mand og kvinde blandes, foregår konjugering mellem han-hun-par. Konjugationsbro er dannet (figur 42.1). Parring inducerer sløjferet cirkelreplikation af 'F' En kopi af 'F' overføres til det kvindelige ma-minut.

Kvinden omdannes til en mand, der ofte passer sammen, og recipientcellen indeholder 'F'-plasmidet. Under overførsel viser både donor- og modtagerceller DNA-syntese. I donoren erstatter syntesen en enkelt streng, som skal overføres, og syntese i recipienten omdanner den overførte enkeltstreng til dobbeltstrenget DNA.

'F' plasmid har en evne til at integrere i det bakterielle kromosom. 'F' sikringer med kromosom øger dets størrelse. Cellen hedder nu Hfr-celle (højfrekvent rekombination). Når en kultur af Hfr blandes med F ^- kultur, opstår der konjugering. Replikation starter i Hfr-cellen, og en replikation overføres til F ^- celle. Replikeringsretningen er sådan, at en lille del af 'F' overføres først, og hoveddelen overføres senere. Kvinde modtager både små og en stor fragement af hankromosomet (figur 42.2).

En Hfr produceres, når 'F' integreres stabilt i chromsome. Et plasmid indeholdende både 'F', gener og kromosomale gener kaldes som 'F' -plasma.

Egenskaber af plasmider:

'F' plasmider:

De bruges som kloningsmiddel i genteknologi.

'R' Plasmid:

Drugresistens eller 'R'-plasmid blev isoleret først fra bakterie Shigella dysenteriae og derefter fra E. coli, Staphylococcus, Pseudomonas, Bacillus, Vibrio, Salmonella osv.' R'Faktor tilvejebringer modstand fra svampe antibiotika. 'R' plasmid består af 2 sammenhængende segmenter af DNA. En af disse er RTF (modstandsoverførselsfaktor).

Det bærer gener regulering af DNA-replikation. Den har molekylvægt 11 × 10 ⁶, den anden segment r-determinant er variabel i størrelse (100 x ¹⁰⁶ molekylvægt) og bærer gener for antibiotikaresistens. Modstandsdygtighed over for lægemidlet penicillin (pen), ampicillin (amp), chloramphanicol (cam), streptomycin (str), kanamycin (kan) og sulfonamid (sul) i kombination er almindeligt (fig. 42.3).

Col Plasmid:

Col plasmid er E. coli plasmid kodende colciner, proteiner, der er i stand til at forhindre vækst af en bakteriestamme, der ikke indeholder col plasmid. Col plasmider er en klasse af generel type plasmid kaldet bakteriocinogent plasmid, der producerer bakteriociner i mange bakteriearter. Bakteriociner, hvoraf coliciner er et eksempel, der er proteiner, der binder til cellevæggen af ​​følsom bakterie og hæmmer vigtige processer, fx replikation, transkription, oversættelse eller energi metabolisme osv. Det bedste studerede col plasmid er col E ₁, med en mol vægt. 4, 2 × 10 ⁶ . Det anvendes til rekombination af DNA-forskning og i et in vitro-DNA. replikationssystem.

Ti plasmid:

Kronegalttumor er forårsaget af Agrobacterium tumefaciens. Ti plasmid er det vigtigste redskab i plantens genteknologi. Sårene inficeres af A. tumefaciens og inducerer tumor på stedet (figur 42.4). Ved begyndelsen af ​​infektion begynder de at syntetisere et argininderivat kaldet opin, fx nopalin eller octopin, og cellerne prolifererer til dannelse af tumor.

Induktionen af ​​tumor styres af genetisk information, der bæres på plasmid kaldet Ti-plasmid. T-DNA og vir-regionen i Ti-plasmidet er essentielt for transformation af planteceller. Plasmidet der forårsager tumor er Ti-plasmid. I en inficeret plante kommer nogle af bakterierne ind og vokser i plantecellen og lyser der og frigiver deres DNA i cellen.

Det lille fragment af Ti-plasmid, der indeholder gener til replikation, bliver integreret i plantecellechromosomerne. Det integrerede fragment bryder ned det hormonregulerede system og kontrolcellefordeling. Cellen vender til tumorcelle. Ti plasmid af Agrobacterium tumefaciens tilvejebringer et fremragende genoverførselssystem til anvendelse i dikotplanter. Værtsområdet er begrænset til kun dicots. Fig. 42.5 Ti plasmider er meget vigtige, da specifikke gener kan indsættes i Ti-plasmidet ved rekombinant DNA-teknikker. Disse gener kan indsættes i plantekromosom, der ændrer genotypen eller fænotypen af ​​planten. Nye sorter af værdi produceres.

Gærplasmid:

Gær har dræberpartikel, som er dobbeltstrenget RNA-molekyle. Det er det eneste plasmid uden DNA. Den indeholder 10 gen til replikation og flere andre til syntese af dræbende partikler (colicin som stof).

Gærplasmid er 3 μm plasmid og mol. vægt. 4 × 10 ⁶ . 60 eksemplarer af dette plasmid / celle findes i gærkernen. Plasmid bruger de samme enzymer, der er nødvendige til replikation af gærkromosomer. Plasmidet integrerer tilsyneladende ikke i værts-DNA'et. Dette plasmid er et nyttigt system til undersøgelse af DNA-replikation i gær. Det virker som en vektor til kloning af fremmede gener i gær ved hjælp af rekombinations-DNA-teknikker.