Oxidase Test på Bakterier for at finde ud af deres evne til at oxidere reduceret Cytochrome C

Læs denne artikel for at lære om oxidasetesten på bakterier for at finde ud af deres evne til at oxidere reduceret cytochrom C:

Princip:

Nogle bakterier har evnen til at oxidere 'reduceret cytochrom C' til stede i deres celler til 'oxideret cytochrom C', da de kan producere enzymet 'cytokromoxidase'.

Den oxiderede cytochrom C producerer lilla farve (Wurster's lilla) med farvestoffet N-tetramethyl-para-phenylendiamin (dvs. oxidasereagens).

I oxidasetesten oversvømmes næringsagaragarplader indeholdende testbakteriens kolonier med opløsningen af oxidasereagens. Hvis bakterierne har evnen til at producere enzymet cytochromoxidase, ændres farven på kolonierne på pladerne til lilla. Hvis bakterierne ikke har evnen til at producere cytokromoxidase, bevarer kolonierne den originale lyserøde farve af oxidasereagenset.

Materialer krævet:

Petriskål, konisk kolbe, bomuldspropper, injektionssløjfer med platin wire, autoklave, bunsenbrænder, laminarflowkammer, disponeringsbeholder, inkubator, Whatman filterpapirstrimmel, oxidasereagens (N-tetramethyl-para-phenylendiamin) næringsstof agar, isolerede kolonier eller rene kulturer af bakterier.

Procedure:

(a) plademetode:

1. To petriskåle rengøres, dækkes med håndværkspapir og bundet med tråd eller gummibånd (figur 7.19). Disse trin såvel som steriliseringen af petriskålene i trin 6 udelades, hvis ovnssteriliserede petriskåle anvendes direkte.

2. Ingredienserne af næringsmiddelagarmedium eller dets færdige pulver, der kræves til 100 ml af mediet, vejes og opløses i 100 ml destilleret vand i en 250 ml konisk kolbe ved omrystning og hvirvling.

3. pH-værdien bestemmes ved anvendelse af et pH-papir eller en pH-meter og justeres til 7, 0 ved anvendelse af 0, 1 N HCI, hvis det er mere eller ved anvendelse af 0, 1 N NaOH, hvis det er mindre.

4. Kolben opvarmes for at opløse agaret i mediet fuldstændigt.

5. Kolben er bomuldsplugget, dækket af håndværkspapir og bundet med tråd eller gummibånd.

6. De to petriskåle og det koniske kolbe indeholdende næringsmiddel agarmedium steriliseres ved 121 ° C (15 psi tryk) i 15 minutter i en autoklav.

7. Efter sterilisering fjernes de fra autoklaven og får lov at afkøle i nogen tid uden at lade mediet størkne. Køling af mediet forhindrer kondensering og akkumulering af vanddråber inde i pladerne. Hvis mediet allerede er blevet tilberedt og størknet under opbevaring, skal det være flydende ved opvarmning forsigtigt, indtil det smelter fuldstændigt.

8. For at forberede nærings agarplader, før det steriliserede næringsmiddel agarmedium afkøles og størkner i varm smeltet tilstand, hældes den aseptisk, fortrinsvis inden i et laminært strømningskammer, ind i de to steriliserede petriskåle (ca. 20 ml hver), således at det smeltede medium dækker helt bunden af petriskålene.

Derefter er pladerne dækket med deres låg og lades afkøle for at størkne mediet i dem. Vanddamp, der kan kondensere på pladens og lågs indvendige overflade, inddampes ved at holde pladerne og lågene i omvendt position i en inkubator ved 37 ° C i ca. 1 time.

9. Hver plade er markeret på undersiden i fire kvartaler.

10. "Spot-inokulering" af testbakterierne udføres aseptisk, fortrinsvis i et laminært strømningskammer, i midten af hvert kvartal ved at gøre en plet (eller lille smear) af bakterierne ved hjælp af en flamme-steriliseret sløjfe. Sløjfen steriliseres efter hver inokulation.

11. De podede plader inkuberes i omvendt position, top ned ved 37 ° C i 24 timer i en inkubator indtil kolonier af bakterierne er synlige.

12. Pladerne oversvømmes med oxidasereagens.

(b) Papirmetode:

1. En Whatman filterpapirstrimmel, dyppet i 1% oxidasereagens, tørres og holdes i mørke.

2. Før brug er det fugtet, og en loop af testbakterierne sættes på den som en plet ved hjælp af en platinatrådsløjfe. Nichrome loop kan oxidere reagenset. Derfor skal platin sløjfe bruges.

3. Stedet observeres efter 10 sekunder.