Oxidase Test på Bakterier for at finde ud af deres evne til at hydrolyse gelatin ved at producere gelatinase

Oxidase Test på Bakterier for at finde ud af deres evne til at hydrolyse gelatin ved at producere gelatinase!

Princip:

Nogle bakterier har evnen til at hydrolyse gelatine, da de kan producere det proteolytiske enzym 'gelatinase'.

Mens gelatinen udfældes ved dannelse af kviksølvproducerende translucens, bliver dets hydrolyserede slutprodukter ikke præcipiteret med mercuricchlorid, for hvilket de ikke frembringer sådan translucens, snarere frembringer gennemsigtighed.

I gelatiniseringsprøven dyrkes testbakterierne på agarplader indeholdende gelatine. Efter at bakteriernes kolonier er synlige, oversvømmes pladerne med en opløsning af mercuricchlorid. Hvis bakterierne har evnen til at hydrolyse gelatine, hydrolyserer dens kolonier gelatinen i mediet i de områder, der omgiver dem, medens resten af ​​pladerne bevarer uhærlig gelatine.

Som et resultat dannes der gennemsigtige klare zoner omkring kolonierne, når de oversvømmes med en opløsning af mercuricchlorid, da de hydrolyserede produkter der dannes omkring dem ikke danner bundfald med mercuricchloridet. På den anden side bliver resten af ​​pladens arealer gennemsigtige, da den uhydrolyserede gelatine i disse områder danner udfældninger med kviksølvchlorid.

Materialer krævet:

Petriskåle, konisk kolbe, bomuldspropper, inokuleringssløjfe, autoklave, bunsenbrænder, laminarflowkammer, kassér krukke, inkubator, Fraizer's gelatinagar, kviksølvchloridopløsning, isolerede kolonier eller rene bakteriekulturer.

Procedure:

1. To petriskåle rengøres, dækkes med håndværkspapir og bundet med tråd eller gummibånd (figur 7.20). Dette trin såvel som steriliseringen af ​​petriskålene i trin 6 udelades, hvis ovnssteriliserede petriskåle anvendes direkte

2. Ingredienserne i Fraizers gelatinagarmedium (indeholdende gelatine som hovedkomponent) eller dets færdige pulver, der kræves til 100 ml af mediet, vejes og opløses i 100 ml destilleret vand i en 250 ml konisk kolbe ved omrystning og hvirvlende .

3. pH-værdien bestemmes ved hjælp af et pH-papir eller en pH-meter og justeres til 7, 2 ved anvendelse af 0, 1 N HCI, hvis det er mere eller ved anvendelse af 0, 1 N NaOH, hvis det er mindre.

4. Kolben opvarmes for at opløse agaret i mediet fuldstændigt.

5. Kolben er bomuldsplugget, dækket af håndværkspapir og bundet med tråd eller gummibånd.

6. De to petriskåle og den koniske kolbe indeholdende Fraizers gelatinagarmedium steriliseres ved 121 ° C (15 psi tryk) i 15 minutter i en autoklav.

7. Efter sterilisering fjernes de fra autoklaven og får lov at afkøle i nogen tid uden at lade mediet størkne. Køling af mediet forhindrer kondensering og akkumulering af vanddråber inde i pladerne. Hvis mediet allerede er blevet tilberedt og størknet under opbevaring, skal det være flydende ved opvarmning forsigtigt, indtil det smelter fuldstændigt.

8. For at fremstille gelatinagarplader, før det steriliserede Fraziers gelatinagarmedium afkøles og størkner i varm smeltet tilstand, hældes det aseptisk, fortrinsvis inden i et laminært strømningskammer, ind i de to steriliserede petriskåle (ca. 20 ml hver), så at det smeltede medium helt dækker bunden af ​​petriskålene.

Derefter er pladerne dækket med deres låg og lades afkøle for at størkne mediet i dem. Vanddamp, som kan kondensere på pladens og lågs indvendige overflade, inddampes ved at holde pladerne og lågene omvendt i en inkubator ved 37 ° C i ca. 1 time.

9. Hver plade er markeret på undersiden i fire kvartaler.

10. "Spot-inokulering" af testbakterierne udføres aseptisk, fortrinsvis inden i et laminært strømningskammer, i midten af ​​hvert kvartal ved at gøre en plet (eller lille smear) af bakterierne ved hjælp af en flamme-steriliseret sløjfe. Sløjfen steriliseres efter hver inokulation.

11. De podede plader inkuberes i omvendt position, top ned ved 37 ° C i 24 til 48 timer i en inkubator indtil kolonier af bakterierne er synlige.

12. Pladerne oversvømmes med opløsning af mercuricchlorid (HgCl2).

Observationer:

Transparente klare zoner dannet omkring bakteriernes kolonier: Gelatinase positiv.

Transparente klare zoner, der ikke er dannet omkring bakteriernes kolonier: Negativ gelatinase.