Orto-Nitrophenyl Galactosid Test på Bakterier for at finde deres evne til at hydrolyse Ortho-Nitrophenyl-PD-Galactoside

Læs denne artikel for at lære om udførelsen af ​​Ortho-Nitrophenyl Galactoside Test på Bakterier for at finde deres evne til at hydrolyse Ortho-Nitrophenyl-PD-Galactoside!

Princip:

Nogle bakterier har evnen til at fermentere lactose. De kaldes 'lactose-fermenterende bakterier' eller 'lactosefomenters'.

De andre, som ikke kan fermentere lactose, kaldes lactose-ikke-fermenterende bakterier «eller» lactose-non-fomenters «.

De lactose-fermenterende bakterier kan producere to enzymer, nemlig 'permease' og 'β-galactosidase', som er involveret i fermentering af lactose. Permease hjælper med indlæsningen af ​​lactose i bakteriecellerne, mens β-galactosidase hydrolyserer lactose til glucose og galactose, er β-galactosidase et intracellulært inducerbart enzym, hvis produktion induceres af tilstedeværelsen af ​​lactose i bakteriens celler.

Mens lactose-fermenterende bakterier kan producere både permease såvel som β-galactosidase, kan lactose-ikke-fermenterende bakterier ikke producere permease, men kan eller kan ikke producere β-galactosidase. ONPG testen udføres for at finde ud af laktose-ikke-fermenterende bakteriers evne til at producere β-galactosidase.

Til dette opløses cellemembranen i de lactose-ikke-fermenterende bakterieceller ved at tilsætte toluen for at frigive alle de intracellulære enzymer, herunder P-galactosidase, hvis den er til stede. Enzymet, β-galactosidase hydrolyserer substratet orthoritrophenyl-β-D-galctosid (ONPG) til ortho-nitrophenol, som er gulfarvet.

I ortho-nitrophenyl galactosid testen (ONPG test) dyrkes testbakterierne på triple sukkerjern agar (TSI agar) skæl, der indeholder laktose. Hvis bakterierne er en lactose-ikke-fermenteret, som angivet ved rød røde og rødt skråning, fremstilles en tyk suspension af bakterierne i saltvand, hvortil der tilsættes toluen efterfulgt af ONPG-opløsning. Hvis bakterierne har evnen til at producere enzymet P-galactosidase, ændres farven af ​​bakteriesuspensionen til gul.

Materialer krævet:

Testrør, konisk kolbe, bomuldspropper, inokuleringssløjfe, inokuleringsnål, autoklave, bunsenbrænder, laminært strømningskammer, kassér krukke, inkubator, TSI agar, toluen, o-nitrophenyl-β-D-galactosid (ONPG) opløsning, isolerede kolonier eller rene kulturer af bakterier.

Procedure:

1. Ingredienserne i TSI agar medium (indeholdende 3 sukkerarter og jern som hovedkomponenter) eller dets færdige pulver, der kræves til 100 ml af mediet, vejes og opløses i 100 ml destilleret vand i en 250 ml konisk kolbe ved ryster og hvirvler (figur 7.16).

2. pH-værdien bestemmes ved anvendelse af et pH-papir eller en pH-meter og justeres til 7, 4 ved anvendelse af 0, 1 N HCI, hvis det er mere eller ved anvendelse af 0, 1 N NaOH, hvis det er mindre.

3. Kolben opvarmes for at opløse agaret i mediet fuldstændigt.

4. Før det størkner, fordeles mediet i varm smeltet tilstand i 5 reagensglas (ca. 20 ml hver).

5. Testrørene er bomuldstoppede, dækket af håndværkspapir og bundet med tråd eller gummibånd.

6. De steriliseres ved 121 ° C (15 psi tryk) i 15 minutter i en autoklav.

7. Efter sterilisering fjernes de fra autoklaven og holdes i en skrå position for at afkøle og størkne mediet for at få TSI-agar-skråninger.

8. Testbakterierne inokuleres aseptisk, fortrinsvis i et laminært strømningskammer, ind i skråningerne ved at stikke ind i rækken og striber på overfladen af ​​skråningerne ved hjælp af en flamsteriliseret nål. Nålen steriliseres efter hver inokulation.

9. De podede slanger inkuberes ved 37 ° C i 24 timer i en inkubator.

10. Hvis bakterien er en lactose-fermenter, er den ikke valgt til ONPG test. Hvis bakterierne er laktose-ikke-fermentor, som angivet ved rød røde og rødt skråning, vælges den til ONPG test.

11. Til et testrør indeholdende 0, 25 ml saltvand sættes en tykk kultur af bakterierne ved hjælp af en flamme-steriliseret sløjfe for at gøre en tyk suspension af bakterierne.

12. En dråbe toluen tilsættes, blandes og inkuberes i 5 minutter ved 37 ° C.

13. O-nitrophenylgalactosidopløsning (ONPG opløsning) tilsættes og inkuberes ved 37 ° C i 30 minutter. Derefter ses farveændringen. Igen observeres farveændring efter 24 timer.

Observationer:

1. Gul farve produceret: ONPG positiv.

2. Bliver farveløs: ONPG negativ.