Nitratreduktionstest på bakterier for at finde ud af evnen til at reducere nitrater
Læs denne artikel for at lære om udførelsen af nitratreduktionstest på bakterier for at finde ud af deres evne til at reducere nitrater!
Princip:
Nogle bakterier har evnen til at reducere nitrater, da de kan producere enzymet 'nitratreduktase'.
Dette enzym, i nærvær af egnet elektrondonor, reducerer nitrater (N0 3 - ) til nitritter (N0 2 - ). Tilstedeværelsen af N0 2 - indikeres af sulfanilsyre og a-naphthylamin, som ændrer farven til rød.
I nitratreduktionstesten dyrkes testbakterierne i et bouillonmedium indeholdende nitrat (N0 3 - ). Hvis bakterierne har evnen til at reducere nitrater, får buljongen en rød farve efter tilsætning af sulfanilsyre og a-naphthylamin.
Hvis der ikke produceres rød farve, indikerer det, at enten N0 3 - ikke reduceres af bakterierne, eller bakterierne producerer stærkt potent nitratreduktase enzym, som hurtigt reducerer N0 3 - ud over N0 2 - til NH 3 og N 2 . For at bekræfte dette tilføjes en lille mængde zinkstøv, hvilket reducerer NO 3 - hvis det er tilgængeligt i mediet, til N0 2 - og derved producerer rød farve.
Således, hvis rød farve er produceret, indikerer det, at N0 3 - er til stede i mediet uændret, og bakterierne ikke har evnen til at reducere nitrater. Hvis der ikke produceres rød farve, indikerer det, at N0 3 - er blevet reduceret ud over N0 2 - til NH 3 og N 2, og bakterierne har evnen til at reducere nitrater.
Materialer krævet:
Testrør, konisk kolbe, bomuldspropper, inokuleringssløjfe, autoklave, bunsenbrænder, laminarflowkammer, kassér krukke, inkubator, nitratboks, zinkstøv, nitratreagens Løsning A, nitratreagens Løsning B, isolerede kolonier eller rene bakteriekulturer.
Procedure:
1. Ingredienserne af nitrat-bouillonmedium (indeholdende nitrat som hovedkomponent) eller dets færdige pulver, der kræves til 100 ml bouillon, vejes og opløses i 100 ml destilleret vand i en 250 ml konisk kolbe ved omrystning og hvirvling ( Figur 7.10).
2. pH-værdien bestemmes ved anvendelse af en pH-papir eller pH-meter og justeres til 7, 2 ved anvendelse af 0, 1 N HCI, hvis det er mere eller ved anvendelse af 0, 1 N NaOH, hvis det er mindre. Kolben opvarmes om nødvendigt for at opløse ingredienserne fuldstændigt.
3. Kødet distribueres i fem reagensglas (ca. 10 ml hver), bomuldsplugget, dækket med håndværkspapir og bundet med tråd eller gummibånd.
4. Brothørrørene steriliseres ved 121 ° C (15 psi tryk) i 15 minutter i en autoklav.
5. Væskeslangene får lov at afkøles til stuetemperatur.
6. Testbakterierne inokuleres aseptisk, fortrinsvis i et laminært strømningskammer, ind i bouillon ved hjælp af en inokuleringssløjfe steriliseret over bunsenflammen. Sløjfen steriliseres efter hver inokulation.
7. De podede bouillonrør inkuberes ved 37 ° C i 48 timer i en inkubator.
8. Der tilsættes 0, 5 ml hver af nitratreagensopløsningen A (indeholdende sulfanilsyre) og nitratreagensopløsning B (indeholdende a-naphthylamin) i hvert reagensglas, rystes godt, og farveændring observeres efter 15 minutter.
Observationer:
1. Rød farve produceret: Nitratreduktion positiv.
2. Rød farve, der ikke produceres: Zinkstøv tilsættes.
(en) Rød farve produceret: Nitratreduktion negativ.
(B) Rød farve ikke produceret: Nitratreduktion positiv.
