Eksperiment på at udføre sur-fast farvning af en bakterier

Forsøg på at udføre syrefast farvning af en bakterie for at finde ud af om det er surt eller ikke-sure!

Formål:

De fleste bakterier kan farves enten ved simpel grundfarvning eller ved gramfarvning, da deres celler nemt optager pletter.

Imidlertid har nogle bakterier en tyk voksagtig cellevæg lavet af lipidmaterialer.

Sådanne bakterier er yderst vanskelige at farves, da almindelige vandige pletter ikke let kan komme ind i deres celler, men en gang farves; det er lige så svært at fjerne pletten ud af deres celler, selv med kraftig anvendelse af syrealkohol som dekolouriseringsmiddel. Disse bakterier farves ved sur-hurtig farvning.

Således er sur-hurtig farvning, som ligner gramfarvning, en differentiel farvningsmetode, som differentierer bakterier baseret på karakteren af deres cellevæg i to grupper som følger:

(1) Syrefaste bakterier:

En bakterie, der er ekstremt vanskelig at blive farvet, men en gang farvet, er det lige så svært at fjerne pletten ud af sine celler, selv med kraftig anvendelse af syrealkohol som dekoleringsmiddel, er en syrefast bakterier (syreholdende bakterier bakterie).

Eksempler: Mycobacterium spp. [M. tuberkulose (TB bakterier), M. leprae (spedalske bakterier), M. smegmatis (naturlige bakterier af smegma) og M. marinum (TB bakterier af marine fisk). De har en tyk voksagtig cellevæg lavet af lipidmaterialer.

(2) Ikke-syrefaste bakterier:

En bakterie, der er let at være farvet og også er let at blive affarvet af syrealkohol som dekoleringsmiddel, er en ikke-syre-hurtig bakterie (ikke-syre-elskende bakterier). Eksempler: Alle bakterier undtagen Mycobacterium spp. I disse bakterier er cellevæggen ikke tyk og voksagtig.

Acid-hurtig farvning er nyttig til at differentiere syrefaste og ikke-sure-hurtige bakterier og også i identifikationen af bakterier tilhørende slægten Mycobacterium.

Princip:

De sure-hurtigbakterier er forskellige fra de ikke-sure-hurtige bakterier, idet de har en tyk voksagtig cellevæg lavet af lipidmaterialer. Almindelige vandige pletter, såsom methylenblåt eller krystalviolet, kan ikke komme ind i deres celler gennem denne voksagtige cellevæg.

Imidlertid er den rødfarvede phenoliske primære pletcarbol fuchsin (carbolsyre eller phenol + basisk fuchsin); som er opløseligt i lipidmaterialerne i cellevæggen, kan komme ind i deres celler gennem cellevæggen og kan bevares inde i cellerne, der giver rød farve til dem.

Penetration er yderligere forstærket ved anvendelse af varme, som driver carbol fuchsin gennem lipoidvæggen i cytoplasma. (En lille ændring af denne Ziel-Neelsen-metode beskriver tilsætningen af et befugtningsmiddel, Turgitol, til pletten, hvilket reducerer overfladespændingen mellem cellevæggen og pletten, hvorved der ikke kræves opvarmning). Cellerne får lov at afkøle for at hærde den voksagtige cellevæg.

Når cellerne udsættes for affarvningsmidlet, syrealkohol, modstår de affarvning, idet den primære plet er mere opløselig i de cellulære voks end i affarvningsmidlet. Efterfølgende, når den er modfarvet med methylenblåt, kan den ikke komme ind i cellerne gennem den voksagtige cellevæg.

Således opretholder de sure-faste bakterier endelig den primære pletts røde farve og fremstår som rød. På den anden side optager de ikke-syrefaste bakterier let den primære plet og undergår affarvning let. Når de er farvet med methylenblåt, tager disse farveløse celler også let op mod pletten og fremstår som blå, i modsætning til de sure raske bakterier, som ser rød ud.

Materialer krævet:

Slide, sløjfe, primær plet (carbol fuchsin), affarvningsmiddel (syrealkohol), modfarve (methylenblåt), varm plade, bouillon / skrå / plantekultur af bakterier, mikroskop, nedsænkningsolie.

Procedure:

1. Et objektglas rengøres ordentligt under ledningsvand, således at vand ikke forbliver som dråber på overfladen (Figur 5.12).

2. Det klæbende vand udslettes med bibulous papir og glideren lufttørres.

3. Et smear af bakterier fremstilles i midten af diaset i to metoder som følger.

(a) Hvis bakterier vokset på agarplade eller agarskråning skal observeres, sættes der en dråbe vand i midten af glideren, og en sløjfe af bakterier fra pladen eller skråningen overføres til den ved en sløjfe steriliseret over flamme . Derefter foretages en bakteriesuspension ved langsom rotation af sløjfen i dråben, og den spredes, indtil et smear opnås.

b) Hvis bakterier vokset i flydende bouillon skal observeres, sættes en dråbe af bakteriesuspensionen direkte i midten af glideren ved hjælp af en flamme-steriliseret sløjfe, og der smøres ved udbredelse.

4. Smøret er lufttørret.

5. Smøret fastgøres ved opvarmning. Opvarmning resulterer i koagulationen af de cellulære proteiner, som følge af, at cellerne holder sig til glidens overflade og ikke vaskes væk under farvning. Varmefiksering sker ved hurtigt at føre glideren højt over en flamme 2-3 gange med smørefladen vendt opad, så smøret ikke bliver opvarmet.

6. Smøret er oversvømmet med carbol fuchsin

7. Glideren anbringes på en varm kogeplade, der gør det muligt at forberede sig til damp i 5 minutter. Temperaturen på varmepladen er således justeret, at kogeproduktionen ikke koger og hurtigt fordampes. Fordampningstabet genopfyldes, således at smøret ikke tørrer op. (Til varmeløs metode spredes smedet i 3-5 minutter med carbol fuchsin indeholdende Turgitol).

8. Glideren fjernes fra varmepladen og afkøles.

9. Overskydende plet vaskes væk fra smøret under forsigtigt flydende ledningsvand, således at vand ikke falder direkte på smøret.

10. Affarvningsmidlet, syrealkohol, tilsættes på smørefasen dråbe, indtil carbol fuchsin ikke vasker ud fra smeden.

11. Syrealkoholen vaskes væk fra smøret under forsigtigt strømning af ledningsvand på en sådan måde, at vand ikke falder direkte på smeden.

12. Smøret er oversvømmet med modfarven, methylenblåt i 2 minutter.

13. Overskydende pletter vaskes væk fra smøret under forsigtigt flydende ledningsvand, således at vand ikke falder direkte på smøret.

14. Glideren blottet tørt med bibulous papir.

15. Glideren klipses til mikroskopets stadium og smøret observeres under lavt strømforbrug og højt tørre mål.

16. En dråbe nedsænkningsolie sættes på smøret.

17. Smøret er observeret under olieinddrivningsmål.