Eksperiment til at dyrke og opregne en bakteriofag
Eksperiment til at dyrke og opregne en bakteriofag!
Princip:
En suspension af bakterier, der er modtagelige for en bakteriofag (virus, der inficerer bakterier), er podet med den bakterieophage og får lov til at vokse som en sammenflydende græsplæne på en agarplade.
Bakteriofagpartiklerne vokser i bakteriecellerne og lyser dem. Lysis af bakteriecellerne resulterer i dannelsen af klare zoner i bakteriens sammenflydende græsplæne. Disse klare zoner kaldes 'plaques'. Hver klar zone antages at være dannet af en enkelt bakteriofagpartikel. Antallet af plaqueformende enheder (PFU'er) repræsenterer således antallet af bakteriofagen.
Seriefortyndingsteknik anvendes i opgørelsen af bakteriofager svarende til den, der anvendes ved opregningen af bakterier. Antallet af fagpartikler indeholdt i en prøve bestemmes ved at tælle antallet af plaques dannet på den podede agarplade og multiplicere dette med fortyndingsfaktoren.
For at bestemme et gyldigt fagantal skal antallet af plaques pr. Plade ikke overstige 300 eller være mindre end 30. Plader med større end 300 PFU'er betegnes som "for mange at tælle" (TNTC), mens plader, der viser færre end 30 PFU'er, betegnes 'for få til at tælle' (TFTC).
Materialer krævet:
Trypton bouillon, trypton blød agar, trypton hård agar, konisk kolbe, reagensglas, steriliserede petriskåle, bomuldspropper, lagerkultur af bakteriofag (Ex: T 2 coliphage), næringsvæskekultyrkultur af bakterierne (Ex: Escherichia coli B), steriliserede pipetter, autoklave, varmtvandsbad, bunsenbrænder, laminært strømningskammer, kassér krukke, inkubator.
Procedure:
1. Femten pipetter (i rør af rustfrit stål) og fem petriskåle steriliseres i en varmluftsovn ved 180 ° C i 3 timer. Alternativt kan de være dækket af håndværkspapir, bundet med tråd eller gummibånd og steriliseret i en autoklav sammen med mediet (figur 8.3).
2. Ingredienserne af trypton-bouillonmedium eller dets færdige pulver, der kræves til 100 ml bouillon, vejes og opløses i 100 ml destilleret vand i en 250 ml konisk kolbe ved omrystning og hvirvling. Dens pH justeres til 7, 5 ved anvendelse af 0, 1 N HCI eller 0, 1 N NaOH efter behov. Kolben opvarmes om nødvendigt for at opløse ingredienserne fuldstændigt.
3. Kødet er fordelt i 10 reagensglas (9 ml hver), bomuldsplugget, dækket med håndværkspapir og bundet med tråd eller gummibånd.
4. Ingredienserne af trypton-blød agar-medium eller dets færdige pulver, der kræves til 100 ml af mediet, vejes og opløses i 100 ml destilleret vand i en 250 ml konisk kolbe ved omrystning og hvirvling. Dens pH justeres til 7, 5 ved anvendelse af 0, 1 N HCI eller 0, 1 N NaOH efter behov. Kolben opvarmes for at opløse agaret i mediet fuldstændigt.
5. Dette flydende medium fordeles i 5 reagensglas (2 ml hver), bomuldsplugget, dækket med håndværkspapir og bundet med tråd eller gummibånd.
6. Ingredienserne af trypton-hårdt agarmedium eller dets færdige pulver, der kræves til 100 ml af mediet, vejes og opløses i 100 ml destilleret vand i en 250 ml konisk kolbe ved opvarmning efter pH-justering til 7, 5. Kolben er bomuldsstoppet, dækket af håndværkspapir og bundet med tråd eller gummibånd.
7. De 10 trypton-buljongør, de 5 trypton-bløde agarrør og det kolbeholdige trypton-hårde agarmedium steriliseres ved 121 ° C (15 psi tryk) i 15 minutter i en autoklav.
8. Det steriliserede trypton-hårde agarmedium i den koniske kolbe hældes i 5 steriliserede petriskåle aseptisk for at opnå 5 trypton-hårde agarplader.
9. En ml af bakteriophagens stamkultur (Ex: T2 coliphage) overføres aseptisk, fortrinsvis i et laminært strømningskammer, til et trypton-buljongrør (9 ml) under anvendelse af en steriliseret pipette. Dette bliver 10 gange fortyndingen (dvs. 10 -1 ). Dette fortyndes aseptisk serielt i de andre ni bouillonrør for at opnå en endelig fortynding på 10 -10 (figur 8.4).
10. De 5 steriliserede tryptonbløde agarrør tages og opvarmes på et vandbad til 100 ° C for at smelte agaret. Rørene afkøles, og de smeltede bløde bløde rør holdes ved 45 ° C.
11. Ud fra de ovennævnte 10 rør indeholdende fag i forskellige koncentrationer udvælges fem rør (dvs. 10 -5, 10 -6, 10 -7, 10-8 og 10-9 ). Fra disse rør overføres aseptisk 1 ml hver til de fem tryptonbløde agarrør under anvendelse af separate steriliserede pipetter.
12. To dråber næringsvæskekultyrkning af bakterierne (Ex: Escherichia coli B) overføres aseptisk, fortrinsvis i et laminært strømningskammer, til hvert trypton-blød agarrør indeholdende bakteriofagen ved fem forskellige koncentrationer ( 10-5 til 10-9 ).
13. Indholdet af de fem trypton bløde agarrør indeholdende bakteriofagen og bakterierne blandes hurtigt ved at rotere mellem håndfladerne.
14. Indholdet hældes aseptisk over de fem trypton-hårde agarplader mærket 10-5 til 10-9, hvorved der dannes et dobbeltlagsplantekulturpræparat. Pladerne svirles forsigtigt og får lov at hærde.
15. Pladerne inkuberes i omvendt stilling ved 37 ° C i en inkubator.
Observationer:
1. Alle pladerne observeres for plaqueformende enheder (PFU'er), der udvikler sig som klare zoner på græsplænen af bakterier.
2. Kun de plader, der har PFU'er mellem 30 og 300, betragtes til optælling af fag. Antallet af PFU'er på hver plade tælles. Plader med mere end 300 PFU'er betegnes som "for mange at tælle" (TNTC), mens plader med færre end 30 PFU'er betegnes som for få til at tælle (TFTC). Sådanne plader overvejes ikke.
3. Baseret på observationerne beregnes antallet af bakteriofager pr. Ml af stamfagkulturen ved anvendelse af følgende formel.
Antal fag / ml = Antal PFU X-fortyndingsfaktor
For eksempel, hvis antallet af PFU'er er 280 i en fortynding på 10-7, så er antallet af fag i stockkulturen af fag 280 X 10 7 fag / ml (= 2, 80 X 10 9 fag / ml).
