Essay on Cloning Vectors, Genomic and cDNA Library

Læs dette essay for at lære om Cloning Vectors, Genomic og cDNA Library. Efter at have læst dette essay vil du lære om: 1. Betydning af kloning Vector 2. Karakteristik af en kloningsvektor 3. Typer af vektorer 4. DNA Library 5. cDNA Library.

Indhold:

Essay om betydningen af kloning vektor
Essay om karakteren af en kloningsvektor
Essay om typer af vektorer
Essay på DNA-biblioteket
Essay på cDNA Library

Essay # 1. Betydning af kloning Vector:

En kloningsvektor kan også betegnes som et kloningsmiddel eller bærer-DNA eller simpelthen som en vektor eller et vehikel. Kloningsvektoren er DNA-molekylet, i hvilket mål-DNA'et indføres til kloning, og som er i stand til replikation i værtsorganisme. Disse vektorer kan være plasmider, bakteriofager, kosmider, virus osv.

Essay # 2. Karakteristik af en kloningsvektor:

En kloningsvektor skal have nogle vigtige egenskaber, der er som følger:

1. Den skal kunne replikere i værtsorganismen efter dens introduktion for at producere flere kopier af mål-DNA sammen med sig selv.

2. Det skal være let at være forberedt, dvs. det skal let isoleres og renses.

3. Det skal være mindre i størrelse for at undgå vanskeligheder under genkloning.

4. Det skal indeholde markørgener (som tet ^r, kan ^r osv.), Som hjælper med at udvælge transformerede celler fra de ikke transformerede.

5. Et unikt spaltningssted skal være til stede for restriktionsenzymer «.

6. En vektor skal indeholde et specifikt kontrolsystem som promotorer, terminatorer, operatører osv., Således at det klonede DNA kan udtrykke sig korrekt.

Essay # 3. Typer af vektorer:

Der er en række forskellige vektorer, der kan anvendes til at klone det ønskede DNA-fragment i en egnet vært. To brede kategorier af vektormolekyler anvendes, nemlig plasmider og bakteriofager. Men nogle andre typer af vektorer er også udviklet som kosmider, fagmider. plantevirus mv.

En kort beskrivelse af forskellige kloningsvektorer er angivet nedenfor:

(1) plasmid-vektorer:

Plasmider er de ekstra kromosomale dobbeltstrengede, lukkede og cirkulære, selvreplikerende DNA-molekyler, der er til stede i bakteriecellerne. Deres størrelse varierer fra 1 kb til mere end 200 kb. Plasmider kan eksistere enten uafhængigt eller kan blive integreret i bakteriekromosomet.

De plasmider, som er integreret i bakteriekromosomet, betegnes som episomer. En række værtsegenskaber tildeles af plasmiderne som kvælstoffiksering, antibiotikaresistens, antibiotikaproduktion, colicin-produktion mv.

Et par mest undersøgte typer af bakterielle plasmider er:

jeg. R-plasmid: De bærer gener for resistens over for antibiotika.

ii. F-plasmid eller fertilitetsfaktor: ansvarlig for konjugering.

iii. Kol-plasmider: Bær gener til coliciner (proteinet der dræber følsomme E.coli-celler).

iv. Ti-plasmider (Tumor-inducerende) og Ri-plasmider (Root-inducerende) fra Agrobacterium spp.

Enkelt kopi og flere kopi plasmider:

Når plasmiderne opretholdes som kun én kopi pr. Bakteriecelle, kaldes de som enkeltkopi plasmider. I modsætning hertil bevares de multiple kopi- eller multikopplasmider normalt som 10-20 kopier pr. Bakteriecelle (figur 1).

Afslappet og stringent replikation af plasmider:

Multi-kopimplasmiderne replikeres under den afslappede replikationskontrol, hvor de undergår mere end en replikation for hver replikation af deres værtsgenom (figur 2).

På den anden side er replikationskontrollen af de enkelte kopiplasmider den samme som for værtsgenomet. Det betyder, at enkeltkopiplasmiderne kun gennemgår én replikation for hver replikation af deres værtsgenom, og dette betegnes som den strengere replikationskontrol.

For at være anvendelig som en kloningsvektor skal plasmidet bære egenskaberne af en god vektor som mindre størrelse, markørgener, unikke spaltningssteder, og den skal kunne replikere på en afslappet måde.

Når plasmiderne replikeres under afslappet replikationskontrol, bliver de akkumuleret i cellen i meget stort antal kopier, kan være 1000 kopier pr. Celle eller mere. I dette tilfælde øges udbyttepotentialet således; Derfor anvendes sådanne plasmider (dvs. multi-kopi plasmider) som kloningsvektorer.

Nogle plasmider kan på grund af specificiteten af deres oprindelse for replikation replikere i kun en art af værtscelle. Andre plasmider har mindre specifik replikationsstart og kan replikere i en række bakteriearter. Disse plasmider kaldes henholdsvis som smal-værtsområde og bred-vært-række plasmider.

Som autonome, selvreplikerende genetiske elementer har plasmider de grundlæggende egenskaber for at gøre dem mulige kloningsvektorer. Imidlertid kan de naturligt forekommende plasmider mangle flere vigtige træk, der er nødvendige for en højkvalitets kloningsvektor.

Derfor må man muligvis modificere de naturlige plasmider ved genteknologi for at opnå de egnede kloningsvektorer, der omtales som de modificerede eller manipulerede plasmidvektorer.

Disse modifikationer kan udføres ved at indsætte gener for antibiotikaresistens eller til afslappet replikation mv i plasmidet. Et antal sådanne modificerede plasmider er blevet opnået, som gør underværker som kloningsvektorer.

pBR322:

Det er et udbredt brug, populært plasmid til molekylær kloning. I navnet hedder p det som et plasmid; BR står for navne på forskere F. Bolivar og R. Rodriguez, der skabte dette plasmid, mens 322 er den numeriske betegnelse givet til dette plasmid af dets skabere, det blev konstrueret i laboratoriet fra naturligt plasmid, således at det ville besidde de ønskelige egenskaber ved en kloning vektor.

De nyttige træk ved pBR322 indbefatter dets mindre størrelse (~ 4, 4 kb) og tilstedeværelsen af to antibiotikaresistensgener, der giver resistens over for ampicillin (ampr) og tetracyclin (tet ^r ). Et andet fordelagtigt træk ved pBR322 er, at den opretholdes ved et højt kopiantal i E. coli, men det har en oprindelse af DNA-replikation, som kun virker i E. coli, og kan derfor ikke let overføres til andre bakterier.

pBR327:

Det er afledt af pBR322 efter at have lavet nogle få ændringer som fjernelse af ~ 1 1 kb segment. I modsætning til pBR322 er det et ikke-konjugativt plasmid og derfor leder det ikke sin egen overførsel til andre E.coli-celler. Det kan opretholdes i et højere antal kopier (45 - 60) pr. E. coli-celle sammenlignet med pBR322.

pUC8:

Denne modificerede plasmidvektor er blevet afledt fra pBR322. Den indeholder lac Z-genet og ampicillinresistent gen (amp ^r ). En af de største fordele ved at anvende dette plasmid som vektor er, at de rekombinante celler kan identificeres i en enkelt-trin-proces. Kloningsforsøg med pUC8 tager derfor næsten halvdelen af tiden sammenlignet med den med PBR322 eller pBR327.

PUC19:

Dette er blevet udviklet fra pBR322. Dens størrelse er ~ 2, 7 kb. Den indeholder et ampicillinresistent gen (amp ^r ), lac Z'-gen, med mange unikke kloningssteder) og en replikationsoprindelse fra pBR322.

(2) bakteriofagvektorer:

Bakteriofager er de virus, der inficerer bakterier. Disse er almindeligt kendt som fag. Bakteriofager angriber bakteriecellerne og injicerer genetisk materiale (DNA eller RNA) i dem, som derefter replikeres og udtrykkes inde i bakterierne. To bakteriofager, der er blevet modificeret og almindeligt anvendt som kloningsvektorer, er Phage-A og Phage-M 13.

Phage lambda (λ) Vector:

Den indeholder ~ 48 kb DNA, der er lineært og dobbeltstrenget med enkeltstrengede komplementære ender af 12 nukleotider (som betegnes som kohæsive ender). Phage-λ. genom har en stor ikke-essentiel region, som ikke er vigtig for cellelyse. I dette λ-genom kan det fremmede DNA indsættes, eller fag-DNA'et kan erstattes af det fremmede DNA.

Efter infektion kommer dette lineære A-genom med fremmed DNA ind i bakteriecellen. Inde i bakteriecellen cirkulerer denne λ-genome ved parring af kohæsive ender. Sådanne forseglede kohæsive ender hedder nu cos-steder (figur 4). Nu kan fagen enten vedtage lytisk eller lysogen fase og producere et antal af dets kopier.

Phage M13 Vector:

Det er en meget lille fag af E. coli, som kun inficerer via sexpilus. Dens DNA er cirkulært, enkeltstrenget og er - 10 kb langt. Efter at have trængt ind i E. coli-cellen syntetiserer dette enkeltstrengede DNA sin gratis streng og bliver således dobbeltstrenget, hvilket er en mellemliggende form kendt som replikativ form (RF).

I denne RF vises den oprindelige streng som '+' og den nye streng vises som streng. Kun '+' strengen er pakket ind i de nye fagcoats. Denne RF af fag M13 virker som et plasmid og anvendes som vektor til kloning (figur 5).

(3) kosmidvektorer:

Cosmid er en kloningsvektor, som består af koststedet for fag X indført i et plasmid. Udtrykket cosmid er afledt af 'cos' og 'plasmid' . Kosmider mangler generne, der koder virale proteiner. Disse anvendes normalt til kloning af DNA-fragmenter op til 45 kb i længden.

Typiske kosmider har følgende egenskaber:

en. Et replikationssted

b. Unikt restriktionssted

c. Et markørgen fra plasmid.

d. En 'cos' -site på ca. 12 baser lang.

e. Størrelsen er lille.

Cos-stedet til stede i kosmid hjælper genomet til cirkulærisering og ligering. Eksempler på kosmidvektorer er c2XB, sCos-serien osv. (Figur 6).

(4) Phagemid Vector:

Et fagemid beskrives som en dobbeltstrenget plasmidvektor, som indeholder en replikationsoprinnelse fra en filamentøs fag ud over plasmidets. Det kan bruges til at syntetisere en enkeltstrenget version af et klonet gen.

Et eksempel på fagemidvektor er pBlueScriptllKS (+/-) (figur 7). Det er en fagemidvektor, som er ~ 2960 bp langt derivat af pUC19. Bogstaverne KS i sit navn repræsenterer, at transkriptionen af lacZ-genet bevæger sig fra restriktionsstedet Kpnl mod Sacl.

Vigtige funktioner i pBlueScript HKS (+/-) vektoren er:

1. Et replikationssted fra fag f1.

2. En lacl-promotor, som supplerer med lac Z-genet.

3. Flere kloningssites (MCS) flankeret af fag T3- og T7-promotorsekvenser i modsatte retninger på de to tråde.

4. Ampicillin Resistance-gen (ampr) er også til stede.

5. Et replikationssted ColEl ori fra et plasmid.

(5) Kunstige kromosomvektorer:

Kunstige kromosomer er faktisk den lille og veldefinerede DNA-sekvens, der er konstrueret som rekombinant kromosom. Disse kunstige kromosomer kan anvendes som vektorer til at transportere meget store klonede fragmenter af DNA.

Forskellige typer kunstige kromosomvektorer er:

YAC:

Gær kunstig kromosom. YAC er en lineær vektor, der opfører sig som gærkromosom.

En typisk YAC består af:

(a) Et centromerisk element (CEN)

(b) En autonomt replikerende sekvens (ARS), dvs. en replikationsstart for gær.

(d) Selekterbare markørgener til gær.

Et almindeligt eksempel på YAC er pYAC3 & dets organisation er vist i det givne fig. 8.

BAC'er anvendes som et alternativ til YAC-kloningsvektor. Disse holdes stabilt i E. coli som en stor enkelt kopi. De er konstrueret ved at anvende F-faktor (fertilitetsfaktor) til stede i E. coli. BAC'er er egnede til kloning af lige store (~ 50 kb eller flere) sekvenser af DNA. Eksempler på BAC-vektorer er pBAC108L, pBeloBACl11 osv.

Andre typer af kunstige kromosomer er:

MAC: Mammale kunstige kromosomer

HAC: Human Artificial Chromosomes.

(6) plantevirusbaseret vektor:

Plantevirus forårsager infektion, der resulterer i indførelsen af deres gener i værtsceller. DNA-insertet, der er forbundet med viralt DNA, kan også afgives i værtscellerne, og således virker plantevirus også som kloningsvektorer. Nogle eksempler på sådan plantevirus er caulimovirus, Gemini-virus, tobamovirus osv.

(7) Animalvirusbaserede vektorer:

Der er en række virusser i naturen, der forårsager sygdomme hos dyr. Dyrevirusers evne til at injicere deres genetiske materiale i værtscelle udnyttes til at designe kloningsvektorer baseret på animalsk virus. Eksempler er adenovirus, retrovirus, baculovirus osv.

(8) Shuttle Vektorer:

Disse vektorer er skabt ved rekombinante teknikker. De har evnen til at replikere i cellerne i mere end én organisme. De kan eksistere både i eukaryote og prokaryote celler. De har to replikationsformer, en specifik for hver værtsorganisme.

Vigtige egenskaber ved transportvektorer er angivet nedenfor:

en. Det er i stand til replikation i mange organismer.

b. Det er lille i størrelse.

c. Valgbare markører er til stede i den for nem genkendelse af vektor.

d. Det er stabilt.

e. Det er ikke-patogen.

Et vigtigt eksempel på shuttle vektorer er YEp (Gær Episomal Plasmid), som kan replikere i Ecoli og gær.

(9) Transposoner eller transponeringselementer kan også anvendes som kloningsvektorer.

Ekspressionsvektor:

Det er en vektor, der er designet på en sådan måde, at DNA insertet integreret med vektor er udtrykt i værtsorganismen. Enkle kloningsvektorer resulterer kun i inkorporering af det fremmede gen i værtscellen. Men når det kommer til at opnå produktion af rekombinante proteiner kodet af dette fremmede gen, har denne kloningsvektor modifikation, som gøres ved at indsætte nogle specielle sekvenser.

En sådan modificeret kloningsvektor, som er udformet til ekspression af fremmed gen (eller DNA-insert) i værtscellerne, kaldes ekspressionsvektor.

Man bør vide her, at de specielle sekvenser, der anvendes til sådan modifikation, er promotorsekvens (tilvejebringer signaler til at starte transkriptionen) og terminatorsekvensen (tilvejebringer signaler til afslutning af transkriptionen). I enkle ord er ekspressionsvektorer de kloningsvektorer, som også indeholder signalerne for proteinsyntese.

Essay # 4. DNA Library:

Det kan også betegnes som genbibliotek. Som udtrykket "bibliotek" betegner; DNA-bibliotek er samlingen af kloner, som bærer forskellige DNA-sekvenser fra en organisme. Så et DNA-bibliotek er en blanding af mange DNA-sekvenser, der er blevet klonet i vektor A-DNA-bibliotek, er gavnligt for isolering af et eller flere beslægtede gener af en organisme og også for opbevaring og analyse af forskellige gener.

På basis af den anvendte DNA-kilde er DNA-biblioteker af to typer:

(i) genomisk bibliotek

(ii) cDNA-bibliotek.

Genomisk bibliotek:

Det er samlingen af kloner af DNA, der er direkte afledt af genomet af en organisme. Et genomisk bibliotek repræsenterer det fuldstændige genom af en organisme.

Trin til konstruktion af genomisk bibliotek er (figur 9):

(a) Hele genomisk DNA ekstraheres fra organismen og renses.

(b) Dette oprensede DNA brydes derpå i fragmenter af størrelse, der er egnede til kloning. Fragmentering af DNA kan udføres enten ved anvendelse af restriktionsendonuclease-enzym eller by-fysiske metoder som skære- eller ultralydbølger osv.

(c) Fragmenter indsættes derefter i kloningsvektorer for at opnå rekombinante DNA-molekyler. Hver vektor består af forskellige fragmenter af DNA.

(d) Denne population af rec-DNA-molekyler overføres derefter til værtscellen til kloning.

(e) En samling af sådanne fragmenter klonet på denne måde betegnes som et genomisk bibliotek. Det genomiske bibliotek for organismer med større genomer er konstrueret med X-fag eller kunstige kromosomvektorer som YAC, BAC osv., Mens plasmidvektorer anvendes til konstruktion af genomisk bibliotek for organismer, der har mindre genomer som bakterier.