I Dole Test for at finde ud af en bakteriers evne til at hydrolyse aminosyre tryptophan (med figur)

I Dole Test for at finde ud af en bakteries evne til at hydrolysere aminosyre tryptofan!

Princip:

Nogle bakterier har evnen til at hydrolyse aminosyretryptophan til indol, da de kan producere enzymet 'tryptophanase'.

Tryptophan hydrolyseres med produktionen af indol, pyrodruesyre og ammoniak. Indol detekteres af farvestoffet, paradimethylaminobenzaldehyd (p-DMAB, dvs. Kovac's reagens), som producerer en lyserød ring. Indol reagerer med p-DMAB for at fremstille forbindelsen 'quinoidal rødviolet forbindelse (rosindolfarvestof)', som er pink i farve. Ringen fremstilles ved overfladen, idet reagenset fremstilles i amylalkohol.

I indolprøven dyrkes testbakterierne i et bouillonmedium indeholdende tryptophan. Hvis bakterierne har evnen til at hydrolyse tryptophan til indol, dannes en pink ring på overfladen af bouillonkulturen ved tilsætning af p-DMAB.

Materialer krævet:

Testrør, konisk kolbe, bomuldspropper, inokuleringssløjfe, autoklave, bunsenbrænder, laminarflowkammer, kassér krukke, inkubator, trypton bouillon, Kovac's reagens (paradimethylaminobenzaldehyd), isolerede kolonier eller rene bakteriekulturer.

Procedure:

1. Ingredienserne af trypton bouillonmedium eller dets færdige pulver, der kræves til 100 ml bouillon, vejes og opløses i 100 ml destilleret vand i en 250 ml konisk kolbe ved omrystning og hvirvling. Trypton virker som en kilde til tryptophan. Derfor er tilsætning af tryptophan til bouillon valgfri (figur 7.3).

2. pH-værdien bestemmes ved anvendelse af et pH-papir eller en pH-meter og justeres til 7, 5 ved anvendelse af 0, 1 N HC1, hvis det er mere eller ved anvendelse af 0, 1 N NaOH, hvis det er mindre. Kolben opvarmes om nødvendigt for at opløse ingredienserne fuldstændigt.

3. Kødet distribueres i fem reagensglas (ca. 5 ml hver), bomuldsplugget, dækket med håndværkspapir og bundet med tråd eller gummibånd.

4. Brothørrørene steriliseres ved 121 ° C (15 psi tryk) i 15 minutter i en autoklav.

5. Væskeslangene får lov at afkøles til stuetemperatur.

6. Testbakterierne inokuleres aseptisk, fortrinsvis i et laminært strømningskammer, ind i bouillon ved hjælp af en inokuleringssløjfe steriliseret over bunsenflammen. Sløjfen steriliseres efter hver inokulation.

7. De podede bouillonrør inkuberes ved 37 ° C i 48 timer i en inkubator.

8. Farvestoffet, para-dimethylaminobenzaldehyd (p-DMAB), (dvs. Kovac's reagens) sættes ned i bouillonrørene (0, 5 ml hver) og observeres efter 1 minut.

Alternativt:

7. Papirstrimler gennemblødt i oxalsyre sættes i mundingen af de podede bouillonrør, således at ca. halvdelen af papirstrimlerne forbliver inden i rørene uden at berøre bouillon og den anden halvdel forbliver ude. Til dette bliver filterpapiret skåret i strimler på ca. 35 mm lange og 5 mm brede. Strimlerne gennemblødes i varm mættet vandig opløsning af oxalsyre og tørres før brug.

8. De podede bouillonrør inkuberes ved 37 ° C i 48 timer i en inkubator.