Dyrkning af bakterier fra faste, flydende og swabprøver (med figur)

Formål:

De vigtigste formål med dyrkning af bakterier er som følger:

1. Forøgelse af antallet af bakterier for at få dem i synlige former som kolonier eller suspensioner.

2. Isolering af bakterier.

3. Vedligeholdelse af ren bestandeskultur og standardkulturer.

4. Opgørelse af bakterier i prøver.

5. Påvisning af bestemte bakterier af interesse for en prøve og dens opregning.

6. Identifikation af bakterier fra koloniegenskaber, vækstegenskaber på slanger og biokemiske aktiviteter i forskellige medier.

Formålet med dette forsøg er imidlertid kun at dyrke bakterier fra væskeformige, faste og overfladeprøver i faste og flydende medier for at få dem i synlige former som kolonier eller suspension.

Princip:

Bakterier dyrkes i steriliseret, næringsmæssigt rig væske eller fast medium. Det flydende medium, kaldet bouillon, er indeholdt i reagensglas for at danne "bouillonrør", mens det faste medium, kaldet agarmedium, er indeholdt i petriskåle for at danne 'agarplader' eller blot 'plader'. Dyrkning af bakterier har brug for noget materiale, som mistænkes for at indeholde bakterier.

De fleste af de ting, vi ser, indeholder bakterier. De er til stede i tænderskrabning, mad, jord, vand, fækalt materiale og selv i de usteriliserede mikrobiologiske medier selv. En bestemt mængde af den homogene suspension af et hvilket som helst af det bakterieholdige materiale inokuleres aseptisk i det steriliserede medium og inkuberes i en inkubator ved 37 ° C i 24 timer.

I flydende bouillon vokser bakterierne som suspension og gør det grumset. På faste agarplader vokser de som kolonier; hver koloni vokser fra en enkelt bakterie. Dyrkning af bakterier sker i de følgende fem trin.

1. Fremstilling af medier

2. Sterilisering af medier og glasvarer

3. Inokulering

4. Inkubation

5. Observation

1. Forberedelse af medier:

Ved fremstillingen af flydende bouillon og halvfaste medier vejes normalt ingredienserne i de fastsatte proportioner og opløses i den nødvendige mængde vand. På nuværende tidspunkt er færdige mediepulvere indeholdende ingredienserne i krævede proportioner tilgængelige.

Til fremstilling af flydende bouillonmedie vejes den foreskrevne mængde pulver (som nævnt på pakningens etiket) og opløses i den nødvendige mængde vand i en konisk kolbe. Ingredienserne opløses ved opvarmning, hældes i reagensglas og steriliseres i autoklav.

Men til forberedelse af faste plader, skråninger og dybe rør vejes den foreskrevne mængde pulver (som nævnt på pakningens etiket) og opløses i den nødvendige mængde vand i en konisk kolbe. Dette fremstillede medium steriliseres først i autoklave og lades derefter afkøle i nogen tid.

Mens det stadig er varmt, inden det størkner, hældes det i steriliserede petriskåle eller reagensglas og får lov at størkne ved afkøling til stuetemperatur. Medier, i meget varm tilstand bør aldrig hældes i beholdere, da det fører til kondensering af vand på beholderens væg, som falder på overfladen af mediet og kan medføre forurening.

2. Sterilisering:

Glasvarer steriliseres i varmluftsovn ved 180 ° C i 3 timer og medier i autoklav ved 121 ° C (15 psi tryk) i 15 minutter. Glasswares kan også steriliseres i autoklave, men medier må aldrig steriliseres i ovnen, da vand undslipper fra medierne, og de dehydreres.

3. Inokulation:

Flydende prøver antages at være homogene suspensioner af bakterier. Til dyrkning i bouillon pipetteres derpå et bestemt volumen af prøven i bouillon aseptisk. Til dyrkning på agarplader pipetteres et bestemt volumen af prøven på den faste agarplade og spredes på overfladen af mediet aseptisk.

For faste prøver homogeniseres en prøve af bestemt vægt someptisk i et bestemt volumen af normal fysiologisk saltvand (0, 85% natriumchlorid) ved anvendelse af en steriliseret stamme og mørtel eller en blender. De fleste af de humane patogener er isotoniske for menneskekroppen (0, 85% natriumchlorid).

Normalt er forholdet mellem prøve og saltvand 1: 9 (1 g + 9 ml; 10 g + 90 ml; 25 g + 225 ml eller 50 g + 450 ml). Et bestemt volumen af denne homogeniserede væske, som antages at være en homogen suspension af bakterier, pipetteres aseptisk til den steriliserede bouillon i reagensglas til bouillonkultur. Til dyrkning på agarplader pipetteres den flydende suspension på overfladen af pladerne og spredes aseptisk.

For overfladeprøver taget for at studere mikrobiologi af faste overflader (bordplader, kropsoverflader eller sår) gnides overfladen med en steriliseret vatpind. Vattensprøjten berøres til overfladen af en steriliseret agarplade. Fra berøringspunktet fremstilles striber af steriliseret sløjfe aseptisk for at isolere bakterierne.

4. Inkubation:

De podede bouillonrør og plader inkuberes ved 37 ° C i 24 timer i en inkubator.

5. Observation:

Turbiditet i flydende bouillon og kolonier på agarplader indikerer vækst af bakterier.

Materiale krævet:

Petriskål (6 nos.), 2 ml pipetter (5 nos.), Reagensglas (5 nos.), Koniske kolber (100 ml, 250 ml og 500 ml-1 hver), 250 ml bægerglas (2 nos.), Glas spreder, rustfrit stålpipetaske, håndværkspapir, tråd (eller gummibånd), ikke-absorberende bomuld, småpinde, loop, ethylalkohol, natriumchlorid (NaCl), 0, 1N saltsyre (HCI), 0, 1N natriumhydroxid (NaOH) ), destilleret vand, næringsvæske, næringsstof, væskeprøve (f.eks. damvand), fast prøve (f.eks. jord), overfladeprøve (f.eks. bordplade, kropsoverflade, sår), pH-papir (eller pH-meter), pistle og mørtel (eller homogenisator), bunsenbrænder, varmluftsovn, autoklav, inkubator, laminært strømningskammer.

Procedure:

1. Fem pipetter (i en rustfrit stålpipetaske), seks petriskåle og et par pistle og mørtel (eller en homogeniserende kop) steriliseres ved 180 ° C i 3 timer i en varmluftsovn. Alternativt kan de være dækket af håndværkspapir, bundet med tråd eller gummibånd og steriliseret i autoklave sammen med medierne (Figur 6.1).

2. 0, 85 g NaCl opløses i 100 ml destilleret vand i et 250 ml bægerglas, og 90 ml af denne saltopløsning hældes i en 100 ml konisk kolbe. Munden er bomuldstoppet, dækket af håndværkspapir og bundet med tråd eller gummibånd.

3. Ingredienserne af næringsmediumsvæskemedium, der kræves til 100 ml af bouillon, vejes. Alternativt vejes den foreskrevne mængde færdiglavet næringsvæskepulver (ingrediensblanding).

4. Ingredienserne (eller det færdige pulver) opløses i 100 ml destilleret vand i en 250 ml konisk kolbe ved omrystning og hvirvling. Dens pH bestemmes ved anvendelse af en pH-papir eller pH-meter. PH indstilles til 7, 0 ved anvendelse af 0, 1 N HCI, hvis det er mere eller ved anvendelse af 0, 1 N NaOH, hvis det er mindre. Kolben opvarmes om nødvendigt for at opløse ingredienserne fuldstændigt.

5. Kødet er fordelt i 5 reagensglas (ca. 10 ml hver), deres mund bomuldstoppet, dækket med håndværkspapir og bundet med tråd eller gummibånd.

6. Ingredienserne af næringsmiddelagarmedium eller dets færdige pulver, der kræves til 200 ml af mediet, vejes og opløses i 200 ml destilleret vand i en 500 ml konisk kolbe ved omrystning og hvirvling.

PH-værdien bestemmes ved hjælp af et pH-papir eller en pH-meter og justeres til 7, 0 ved anvendelse af 0, 1N HC1, hvis det er mere eller ved anvendelse af 0, 1N NaOH, hvis det er mindre. Kolben opvarmes for at opløse agaret i mediet fuldstændigt. Derefter er den bomuldsplugget, dækket af håndværkspapir og bundet med tråd eller gummibånd.

7. Swabs er lavet ved at dreje bomuld omkring spidserne af små pinde. Få sådanne vatpind holdes i et reagensglas med bomuldstipene nedad. Testrøret er bomuldsplugget, dækket af håndværkspapir og bundet med tråd eller gummibånd.

8. Den 100 ml koniske kolbe med 90 ml saltopløsning, de 5 reagensglas med næringsvæske, den 500 ml koniske kolbe indeholdende 200 ml næringsmiddel-agarmedium, og prøveløret indeholdende vatpindene steriliseres ved 121 ° C (15 psi tryk) for 15 minutter i en autoklave.

9. Efter sterilisering fjernes de steriliserede materialer fra autoklaven og får lov at afkøle i nogen tid uden at lade mediet størkne. Køling af mediet forhindrer kondensering og akkumulering af vanddråber inde i pladerne. Hvis mediet allerede er blevet tilberedt og størknet under opbevaring, skal det være flydende ved opvarmning forsigtigt, indtil det smelter fuldstændigt.

10. For at forberede næringsmiddelagarpladerne, inden det steriliserede næringsstof agarmedium afkøles og størkner i varm smeltet tilstand, hældes den aseptisk i de 6 steriliserede petriskåle (ca. 20 ml hver), således at det smeltede medium dækker bunden af petriskålene helt.

Derefter er pladerne dækket med deres låg og lades afkøle for at størkne mediet i dem. Vanddamp, der kan kondensere på pladens og lågs indvendige overflade, inddampes ved at holde pladerne og lågene i omvendt position i en inkubator ved 37 ° C i ca. 1 time.

11. Væskeprøven (mistænkt for at indeholde bakterier, fx dam vand) tages. En ml hver af prøverne pipetteres aseptisk i 2 buljongrør (figur 6.2). Rørene er hvirvet. Væskeprøven pipetteres også aseptisk på 2 agarplader, 0, 1 ml hver og spredes på overfladen af agarmediet under anvendelse af en flamme-steriliseret glasspreder.

Før hver spredning af glassprederen dyppes den i alkohol og flammes over en bunsenbrænder. De podede bouillonrør og plader inkuberes ved 37 ° C i 24 timer i en inkubator. Pladerne inkuberes i omvendt position, nedad.

12. For den faste prøve (f.eks. Jord) er 10 g af prøven aseptisk vejet og homogeniseret i den steriliserede stamme og mørtel eller homogeniseringskappe efter tilsætning af 90 ml af den steriliserede saltopløsning fra den 100 ml koniske kolbe.

Denne homogene bakteriesuspension pipetteres aseptisk i 2 bouillonrør og 2 agarplader som i trin 11 og inkuberes ved 37 ° C i 24 timer i inkubatoren (figur 6.2). Pladerne inkuberes i omvendt position, nedad.

13. Til overfladeprøveudtagning er overfladen, der mistænkes for at indeholde bakterier (bordplade, kropsoverflade, sår) markeret for et enhedsareal (fx 1 cm ² ), som gnides af en steriliseret vatpind. Vattensprøjten er rørt på overfladen af de to udadrettede agarplader.

Streaking udføres aseptisk ved en flamme-steriliseret sløjfe. Til striber trækkes næsten parallelle linjer af løkken fra swab-touch-punktet. Disse danner de primære striber. Efter flamme-sterilisering af løkken trækkes sekundære striber næsten diagonalt til de primære striber. På lignende måde fremstilles tertiære og kvaternære striber aseptisk.

14. Derefter inkuberes pladerne i omvendt position, top ned ved 37 ° C i 24 timer i inkubatoren (figur 6.2).

15. En ikke-inokuleret agarplade og et uinokuleret bouillonrør inkuberes som kontrol for at sikre korrekt sterilisering som indikeret ved ingen vækst i dem. Dette trin er valgfrit.