Bakterier til stede i en prøve ved hjælp af seriel dilution agarplating metode eller total pladetælling (TPC) metode

Total Plate Count (TPC):

At opregne bakterier til stede i en prøve ved hjælp af seriel fortyndings agarbelægningsmetode eller total pladeantal (TPC) metode.

Formål:

Omfanget af bakteriel aktivitet i en given prøve i et bestemt sæt betingelser afhænger hovedsageligt af det samlede antal bakterier, der er til stede i det, uanset deres art.

Derfor er det meget ofte nødvendigt at finde ud af det samlede antal bakterier, der er til stede i prøver af mad, vand, jord, luft og væv under deres mikrobiologiske analyse. Dette samlede antal bakterier omfatter både levende og døde bakterier. ' Døde bakterier kan ikke vokse og reproducere.

Det er kun de levende bakterier (levedygtige bakterier), som kan vokse og formere sig, hvilket resulterer i specifik bakteriel aktivitet. Derfor er det meget ofte nødvendigt at opregne de levedygtige bakterieceller i forskellige prøver. Imidlertid tæller de fleste opregningsmetoder som direkte mikroskopiske tæller, elektroniske celleantal, kemiske metoder og spektrofotometrisk metode både levende såvel som døde celler.

Disse metoder kan ikke diskriminere mellem levende og døde celler. Derfor er seriel fortyndings-agarpletteringsmetode, som kun opregner de levedygtige bakterieceller, den universelt anvendte metode til at tælle levende levedygtige celler i forskellige prøver.

Princip:

En bestemt vægt af fast prøve homogeniseres aseptisk i ni volumener steril saltvand for at opnå en homogen suspension af bakterier. Den flydende prøve anvendes direkte som homogen suspension af bakterier. Suspensionerne af de således opnåede bakterier fortyndes serielt (10 gange, 100 gange, 1000 gange etc.). Her kaldes 10-1, 10-2, 10-3 osv. Fortyndinger.

Deres reciprocals (10 1, 10 2, 10 3 etc.) kaldes fortyndingsfaktorer. Et bestemt volumen af ​​suspensionen af ​​bakterier fra hver fortynding inokuleres på agarplader og spredes ordentligt for at rumme de enkelte bakterieceller bredt fra hinanden og isolere dem fra hinanden.

Inokuleringen af ​​bakterier til dens opregning udføres i to teknikker som følger:

1. Hæld tallerken teknik

2. Spread plate teknik

1. Hæld tallerkenteknik:

I denne teknik sættes 1 ml af bakteriesuspensionen på en steriliseret petriskål, hvorefter flydende næringsstof agar medium hældes over det. Petriskålen bliver svirvet forsigtigt, så suspensionen blandes med mediet ensartet. Det får lov at afkøle og størkne.

2. Spread Plate Teknik:

I denne teknik droppes 0, 1 ml af bakteriesuspensionen på en fremstillet agarplade. Derefter spredes suspensionens suspension ensartet på agarpladen ved hjælp af en steriliseret glaspreder.

For at minimere fejlen pletteres hver fortyndet suspension på 2-5 replikatplader. De podede plader inkuberes ved 37 ° C i 24 timer. I løbet af denne periode vokser og multiplicerer hver enkelt isoleret bakteriecelle på agarpladen og multiplicerer hurtigt for at frembringe en makroskopisk synlig masse af bakterieceller kaldet en 'koloni'. Antallet af kolonier på pladen repræsenterer således antallet af bakterier i prøven.

Imidlertid kan nogle celler meget ofte ikke spredes ordentligt under spredning, og få sådanne ikke-adskilte celler kan give anledning til en enkelt koloni. Desuden har få celler tendens til at forblive i par, kæder eller klynger.

Her producerer hvert par, kæde eller klynge en koloni. Således repræsenterer hver koloni i strengt forstand ikke en enkelt bakterie. Det er derfor, i stedet for at udtrykke bakteriernes tal som "Nej. af bakterier / gm eller ml prøve ', udtrykkes det meget ofte som antal kolonidannende enheder pr. g eller ml (CFU / gm eller ml).

Den samlede pladeantal (TPC) i den oprindelige prøve beregnes ved at multiplicere antallet af CPU'er med de respektive fortyndingsfaktorer. 'Reglerne for opregning' følges, mens man beregner antallet af bakterier i den oprindelige prøve.

Materialer krævet:

Petriskål (15 nos.), 2 ml pipetter (10 nos.), 10 ml pipette (1 nr.), Prøverør (10 nos.), Koniske kolber (500 ml og 1 liter -1 hver), 500 ml bægerglas (2 nos.), Glaspreder, pipetter af rustfrit stål, håndværkspapir, tråd (eller gummibånd), ikke-absorberende bomuld, ethylalkohol, natriumchlorid (NaCl), 0, 1 N saltsyre (HCI) 0, 1N natriumhydroxid (NaOH), destilleret vand, nærings agar, flydende prøve (f.eks. Damvand / spildevand), fast prøve (f.eks. Jord / fiskekød / østerskød / forarbejdet mad), pH-papir (eller pH-meter) og mørtel (eller homogenisator), bunsenbrænder, varmluftsovn, autoklav, inkubator, laminært strømningskammer, Quebec kolonistæller.

Procedure:

1. Ti pipetter (i en rustfrit stålpipetaske) steriliseres 15 petriskåle og et par pistle og mørtel (eller en homogeniserende kop) i varmluftsovn ved 180 ° C i 3 timer. Alternativt kan de være dækket af håndværkspapir, bundet med tråd eller gummibånd og steriliseret i autoklav sammen med mediet (figur 6.6).

Antallet af petriskåle og dermed mængden af ​​medium, som skal anvendes, beregnes afhængigt af antallet af replikationer og fortyndinger, som kræves. Her er glasvarer og mediet taget for enkelt replikation og fortynding op til 10 -6 . Antallet af glasvarer og mængden af ​​medium der tages til sterilisering er lidt mere for at undgå enhver tilfældig fejl, fordi sterilisering er en lang proces.

2. 4, 25 g NaCl opløses i 500 ml destilleret vand for at få fysiologisk saltvand (0, 85%). 225 ml af denne saltopløsning hældes i en 500 ml konisk kolbe. Dens mund er bomuldsplugget, dækket af håndværkspapir og bundet med tråd eller gummibånd. Det anvendes som de første fortyndingsmidler til fortynding af den faste prøve.

3. 9, 0 ml af den resterende saltvand pipetteres også i hvert af de 10 reagensglas. Munden er bomuldstoppet, dækket af håndværkspapir og bundet med tråd eller gummibånd. Disse anvendes som fortyndingsmidler til seriel fortynding.

4. Ingredienserne af næringsmiddel agarmedium eller dets færdige pulver, der kræves til 500 ml af mediet, vejes og opløses i 500 ml destilleret vand i en 1 liter konisk kolbe ved omrystning og hvirvling.

PH-værdien bestemmes ved hjælp af et pH-papir eller en pH-meter og justeres til 7, 0 ved anvendelse af 0, 1N HC1, hvis det er mere eller ved anvendelse af 0, 1N NaOH, hvis det er mindre. Kolben opvarmes for at opløse agaret i mediet fuldstændigt. Derefter er den bomuldsplugget, dækket af håndværkspapir og bundet med tråd eller gummibånd.

5. Den 500 ml koniske kolbe indeholdende 225 ml saltvand, de 10 reagensglas indeholdende 9 ml saltvand hver og den 1 liter koniske kolbe indeholdende 500 ml nærings agarmedium steriliseres ved 121 ° C (15 psi tryk) i 15 minutter i en autoklave.

6. Efter sterilisering fjernes de steriliserede materialer fra autoklaven og får lov at afkøle i nogen tid uden at lade mediet størkne. Køling af mediet forhindrer kondensering og akkumulering af vanddråber inde i pladerne. Hvis mediet allerede er blevet tilberedt og størknet under opbevaring, skal det være flydende ved opvarmning forsigtigt, indtil det smelter fuldstændigt.

7. For at forberede agarpladerne, hældes det og steriliseres i varm smeltet tilstand i aseptisk form i de 6 steriliserede petriskåle (ca. 20 ml hver), således at det smeltede medium dækker bunden af ​​petri retter helt.

Derefter er pladerne dækket med deres låg og lades afkøle for at størkne mediet i dem. Vanddamp, der kan kondensere på pladens og lågs indvendige overflade, inddampes ved at holde pladerne og lågene i omvendt position i en inkubator ved 37 ° C i ca. 1 time.

8. 25 g af den faste prøve (fx fiskekød / østerskød / forarbejdet mad) vægtes og homogeniseres i 225 ml steriliseret saltvand (fortyndingsmiddel) aseptisk (figur 6.7). Dette giver en 10 gange fortynding (fortynding = 10 -1 ). Til den flydende prøve pipetteres 1 ml prøve aseptisk i et 9 ml steriliseret saltvandsslang. Dette giver også en 10 gange fortynding (fortynding = 10 -1 ).

9. 1 ml af 10-1 fortyndingen overføres til 9 ml steriliseret saltopløsning i et andet reagensglas. Dette giver 100 gange fortynding (fortynding = 10-2 ). Fra 10 -2 fortyndingen sættes 1 ml i en steriliseret petriskål og 0, 1 ml på en agarplade fra samme pipette. Til hver fortynding anvendes en separat steriliseret pipette. Efter brug dyppes den i kassetten.

10. 1 ml af 10-2 fortyndingen overføres til 9 ml steriliseret saltopløsning i et andet reagensglas. Dette giver 1000 gange fortynding (fortynding = 10 -3 ). Fra 10 -3 fortyndingen sættes 1 ml i en steriliseret petriskål og 0, 1 ml på en agarplade fra samme pipette. På lignende måde fortsættes fortyndingen op til 10 -6 serielt hver gang overførsel af 1 ml til en steriliseret petriskål og 0, 1 ml til en agarplade fra den samme pipette.

11. Derefter spredes suspensionsdråberne på agarpladerne aseptisk ved hjælp af en steriliseret glaspredere. Efter spredning i hver plade er den flamsteriliseret ved at dyppe i alkohol og vise over en flamme. Dette er 'spread plate-teknikken'.

12. Petriskålene indeholdende 1 ml bakteriesuspension hver tages og steriliseret flydende næringsstofagar hældes i dem. De svirles forsigtigt, så suspensionen blandes med mediet ensartet. Pladerne får lov at afkøle, indtil mediet størkner. Dette er 'pour plate technique'.

13. Derefter inkuberes pladerne i omvendt position, top ned ved 37 ° C i 24 timer i en inkubator (figur 6.7).

14. En ikke-inokuleret agarplade inkuberes som kontrol for at sikre korrekt sterilisering som vist ved ingen vækst på den.

Observationer:

Antallet af kolonier af bakterier på pladerne tælles direkte eller ved hjælp af en Quebec kolonistæller. Herfra beregnes antallet af bakterier pr. Gram eller ml af den oprindelige prøve. Dette kaldes opregning.

Regler for opregning:

1. Petriskål med 30 til 300 kolonier bør overvejes.

2. Gennemsnitligt antal duplikater og triplikater (R 1, R 2 R 3 ...) betragtes kun, hvis en tælling ikke er mere end dobbelt af den anden. Hvis en er mere end dobbelt af den anden lavere værdi er taget.

3. Ved hældning af pladeteknik er bakterietallet nr. X 10 c / gm, hvor c = fortyndingsfaktor. Til spredningsteknikteknik er bakterietallet nr. X10 c + 1 / gm, hvor c = fortyndingsfaktor. Nummeret konverteres til to decimaler i form af (x.yz X 10 m ). For eksempel udtrykkes 288 X 10 4 som 2, 88 X 10 6 .

4. Hvis kolonienummeret i alle fortyndinger er over 300, tæller for højeste fortynding, og hvis den i alle fortyndinger er mindre end 30, tæller den laveste udtynding, der overvejes. I begge tilfælde er tællingen repræsenteret som: Estimeret nr. X 10 c / gm eller ml til hældningsteknikteknik og estimeret nr. X 10 c + 1 / gm eller ml til spredte plade teknik.

5. Hvis der ikke observeres nogen koloni i en eventuel fortynding, er den repræsenteret som: Estimeret <1 x laveste fortynding.

6. Da den serielle fortynding finder sted i form af 10 gange, er det matematisk klart, at ingen to fortyndinger kan have kolonier mellem 30 og 300. For eksempel, hvis 10 -3 har 50 kolonier, skal 10 -2 have 500 (dvs.> 300) og 10 -4 bør have 5 (dvs. <30) kolonier.

Dette sker imidlertid ikke i virkeligheden, da bakterier ikke forekommer som en homogen opløsning; forekommer snarere som en suspension i fortyndingsmidlet. Hvis der er to fortyndinger, der har tællelige kolonier (mellem 30 og 300) beregnes først antallet af kolonidannende enheder / gm eller ml ved anvendelse af hver fortynding.

Hvis en værdi er mere end dobbelt af den anden, skal du rapportere den lavere værdi. Hvis ikke, tag gennemsnittet af de to værdier og rapporter denne værdi.